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水稻是世界上超过一半的人口的主要粮食作物,而由黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzaae,Xoo)引起的水稻白叶枯病(Bacterial blight,BB)是影响其产量的主要病害之一。WRKY转录因子是与植物抗病密切相关的转录因子,对其研究不仅有助于我们了解植物抗病防御反应机制,并且能为传统育种和基因工程育种提供基因资源和相关理论指导。本实验室前期研究中,发现一个抗病相关基因OsWRKY28。此外,近年来,CRISPR/Cas9系统因其定点突变效率高被成功运用于多种物种的基因编辑中。本研究围绕测试改造后的CRISPR/Cas9系统效率和分析OsWRKY28基因的功能展开,研究的内容主要如下:1.CRISPR/Cas9载体改造及应用其编辑水稻D3基因以测试效率以现有水稻CRISPR/Cas9载体系统为起点,优化改造了相应的载体及其构建方法,实现了两步法构建基因编辑载体。利用新的载体和方法,针对水稻日本晴(Oryza sativa L.spp.Japonicaa cv.Nipponbare)D3 基因的 3 个靶向位点分别构建了相应的CRISPR/Cas9载体,并通过农杆菌介导的遗传转化成功获得一系列转基因植株。T0代转基因植株靶位点测序结果显示,靶位点DDRC1包括5种突变类型,植株的突变率为35.48%;靶位点DDRC2包括5种突变类型,植株的突变率为25.00%;靶位点DDRC3包括1种突变类型,植株的突变率为20.00%。利用T1代纯合突变植株,我们进一步研究了所得纯合突变体的株高、分蘖数表型与CRISPR/Cas9编辑后基因型之间的关系,探讨了 CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率、位置效应和突变类型等特点,为进一步利用CRISPR/Cas9系统发展具有不同农艺性状的水稻种质材料提供了参考。2.Os WRKY2sCRISPR/Cas9 材料的创制应用改造后的CRISPR/Cas9基因编辑载体,构建了一个靶向OsWRKY28基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体,经农杆菌介导的水稻日本晴遗传转化方法获得了转基因植株,T0代转基因植株靶位点测序结果显示,突变率为38.46%。在T1代成功获得了四种纯合突变材料,突变体Mutantl为缺失四个碱基(CCAA),突变体Mutant2为插入一个碱基(C),突变体Mutant3/4a为插入一个碱基(T),突变方体Mutant4b为插入一个个碱基(A)。3.Os WRKYsW基因的表达特性分析亚细胞定位结果显示,OsWRKY28基因的N端融合GFP在原生质体细胞和烟草叶片细胞的细胞核中表达,C端融合GFP在原生质体细胞和烟草叶片细胞中的细胞核和叶绿体中表达。酵母转录激活实验结果表明,OsWRKY28全长与GAL4-BD的融合蛋白不能激活下游报告基因的表达,也就是说OsWRKY28全长不具有自激活活性。采用RT-PCR对OsWRKY28基因的组织表达进行分析,结果表明,OsWRKY28基因在叶片、剑叶和幼花中的表达量较低,而在根、茎中的表达量较高。OsWRKY28响应不同激素、模拟环境胁迫处理以及接种白叶枯病菌的结果显示,与对照组相比,JA、KT、6-BA、NAA、GA以及白叶枯病菌能够以不同程度诱导叶片和根中OsWRKY28的表达,此外,SA、IAA以及H202、NaCl、PEG模拟逆境处理后,能够不同程度的诱导叶片中OsWRKY28的表达,推测OsWRKY28基因可能参与了激素抗病信号转导途径。4.OsWRKY28超表达材料的获取及初步分析构建了OsWRKY28基因的超表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因植株。对T1代转基因植株进行阳性鉴定以及表达量分析,结果表明,T1代OsWRKY28超表达材料中OsWRKY28的表达量相对于野生型都是超表达的。并对部分OsWRKY28超表达植株中markergene(PR1b、PR5、PR10a)的表达量进行了分析,结果显示,PR1b、PR5、PR10a基因的表达量在部分植株中上调表达。此外,对T1代阳性植株的抗病性进行了初步检测,接菌实验结果表明,OsWRKY28基因超表达材料的病斑长度小于野生型的病斑长度。初步推测OsWRKY28基因很可能通过诱导PR基因的表达来参与调控水稻对白叶枯病菌的响应。