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目的 本实验用干冰造成大鼠脑的右侧顶叶局部冻伤，引起脑水肿。用免疫组织化学和透射电镜的方法，观察脑水肿时间藤细胞的增时变化。特别是应用免疫金电镜技术，对细胞包含体内的组织蛋白酶cathepsin D进行定位定量研究。 方法 1．动物模型 40只雄性Wistar大鼠，生后4个月。用牙钻在右侧顶骨钻一个直径2毫米的小孔，注意不破坏硬脑膜，然后将小块干冰置于硬脑膜上，造成脑局部冻伤，引起脑水肿，对照组为只开孔，不使用干冰冻伤的假手术组。在手术后5小时，10小时，1天，2天，3天，1周，2周，用4％多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.4)经心脏灌流固定，取出脑，切取包括损伤部位的2毫米厚冠状切片，浸泡固定在各种固定液中，制成供光镜，传统的透射电镜及免疫金电镜技术使用的标本。 2．辣根过氧化物酶(HRP)注射 部分大鼠在手术后各不同时间从股静脉注射辣根过氧化物酶(HRP，Sigma Type Ⅱ)，1小时后灌流固定，取出脑，切取包括损伤部位的2毫米厚冠状切片，再用振动切片机切成40微米厚的冠状切片。用酶组织化学方法(Vector SG过氧化物酶底物试剂盒，SK-4700)染色，用1％核固红复染核，观察HRP从血管渗出以及被间藤细胞摄取的情况。 3．透射电镜 在脑冠状切片上，将脑损伤部外侧2～4mm区域的大脑皮质切成小块，放入2％多聚甲醛，2．5％戊H醛磷酸缓冲液K℃）中浸泡固定4小时。固定后经磷酸缓冲液多次清洗，再用1％饿酸后固定2小时。乙醇梯度脱水后，常规 EPon－812包埋，超薄切片置于铜网上，用醋酸双氧铀和拘椽酸铅复染后，用皿M－220EX型透射电镜观察，拍照。 4．免疫荧光双标记法 将2毫米厚脑冠状切片，放人4％多聚甲醛磷酸缓冲液k℃）中浸泡固定4小时。经过梯度蔗糖磷酸缓冲液浸泡后，置于液氮中快速冷冻数秒，取出后置于箱式冰冻切片机内（－24℃X制作12－14微米厚的冰冻切片。用红色荧光标记EDZ，第一抗体是Anti－EDZuerotec，MCA342RX第二抗体是Texas red anti－mouse IgG Vector oomtories）；用绿色荧光标记ca－thepsin D，第一抗体是 Anti－cathepsin D（Santa C。z Biotechnolo瓢，SC－6487），第 ＝抗体是 luorescein anti－goat IgG（Vector Laboratories，H－5000）。用 OLIMPUS AX80TR型显微镜观察，拍照。 5．免疫金电镜技术 在脑冠状切片上，将脑损伤部外侧2－4mm区域的大脑皮质切成小块，放人 4％多聚甲醛，0．25％戊二醛，0．二％单宁酸固定液中，经微波照射 20秒固定后，再浸泡固定4／J’时kt人按照Benyma。和Rodewald方法，用LR Gold树脂包埋。 超薄切片置于复盖有colloidion膜的镍网上，进行兔疫金标记。第一抗体是 Anti－cathepsin D（Santa C皿 Biotechnology，SC－6487），第二抗体是Blotlylated antlgoat IgG（Vector Laboratones，BA一 95000），15urn gold EMStreptavidin（BBInte＊ational，40399）在室温下依次各孵育一小时，用金粒子标记CathePsin D。用醋酸双氧铀和拘椽酸铅轻度复染后，用JEM—2000EX型透射电镜观察，拍照，并进行定量分析。 结 果 1．辣根过氧化物酶反应 大鼠脑局部冻伤互小时，2小时和1天后，在直接冻伤的区域，血管被严重破坏，可见许多红细胞散在于脑组织内，并可见弥漫的HRP的蓝黑色反应产物。在此区域，脑组织被严重破坏，结构不清，也无法观察到结构清 ·二·楚的间藤细胞。而在脑损伤部外侧2－4mm区域的大脑皮质，组织结构清楚，血管（微动脉或微静脉）旁的间藤细胞，因吞入了大量的HRP，而清晰可见。这说明脑局部冻伤会引起血脑屏障破坏，静注的HRP从血管渗出，并被间藤细胞摄取。另外，在未损伤侧只见到少数的间藤细胞，摄取了小量的HRP，呈现沿血管长轴延伸的细长的形态。与未损伤侧相比较，可以看出，损伤侧的间藤细胞外形改变是变短变粗。在损伤一周后，在损伤侧再也见不到HRP的反应产物，这说明此时HRP已经停止从血管渗出。 2．透射电镜 在对照组，间藤细胞位于脑微血管平滑肌基底膜和星状胶质细胞的胶质膜之间。细胞质内有许多大型的高电子密度的包含体门nclusion body，IB入有时可见少量空泡或内吞小泡。在冻伤后10小时，在间藤细胞内，有的包含体电子密度降低，并出现蜂窝状包含体，在临近细胞膜的细胞质内可见吞饮小泡增加。在冻伤后2天，除了体积增大的包含体外，可见到许多小型的包含体，而且，蜂窝状包含体增多。也就是说，间藤细胞内包含体的数量增加；体积大的和体积小的空泡的数量都增加，因此细胞的体积增大。 3，免疫荧光双标记 在对照组，EDZ阳性反应存在于微血管旁，因EDZ为大鼠组织巨噬细胞的标志性抗原，常用来标识间藤细胞。所以，此EDZ阳性细胞为间藤细胞。同时，此细胞内可见到明显的CathePsin D阳性反应，这说明间藤细胞含有大量的 CathePsin D。在实验组，EDZ与C