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目的 本实验用干冰造成大鼠脑的右侧顶叶局部冻伤,引起脑水肿。用免疫组织化学和透射电镜的方法,观察脑水肿时间藤细胞的增时变化。特别是应用免疫金电镜技术,对细胞包含体内的组织蛋白酶cathepsin D进行定位定量研究。 方法 1.动物模型 40只雄性Wistar大鼠,生后4个月。用牙钻在右侧顶骨钻一个直径2毫米的小孔,注意不破坏硬脑膜,然后将小块干冰置于硬脑膜上,造成脑局部冻伤,引起脑水肿,对照组为只开孔,不使用干冰冻伤的假手术组。在手术后5小时,10小时,1天,2天,3天,1周,2周,用4%多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.4)经心脏灌流固定,取出脑,切取包括损伤部位的2毫米厚冠状切片,浸泡固定在各种固定液中,制成供光镜,传统的透射电镜及免疫金电镜技术使用的标本。 2.辣根过氧化物酶(HRP)注射 部分大鼠在手术后各不同时间从股静脉注射辣根过氧化物酶(HRP,Sigma Type Ⅱ),1小时后灌流固定,取出脑,切取包括损伤部位的2毫米厚冠状切片,再用振动切片机切成40微米厚的冠状切片。用酶组织化学方法(Vector SG过氧化物酶底物试剂盒,SK-4700)染色,用1%核固红复染核,观察HRP从血管渗出以及被间藤细胞摄取的情况。 3.透射电镜 在脑冠状切片上,将脑损伤部外侧2~4mm区域的大脑皮质切成小块,放入2%多聚甲醛,2.5%戊H醛磷酸缓冲液K℃)中浸泡固定4小时。固定后经磷酸缓冲液多次清洗,再用1%饿酸后固定2小时。乙醇梯度脱水后,常规 EPon-812包埋,超薄切片置于铜网上,用醋酸双氧铀和拘椽酸铅复染后,用皿M-220EX型透射电镜观察,拍照。 4.免疫荧光双标记法 将2毫米厚脑冠状切片,放人4%多聚甲醛磷酸缓冲液k℃)中浸泡固定4小时。经过梯度蔗糖磷酸缓冲液浸泡后,置于液氮中快速冷冻数秒,取出后置于箱式冰冻切片机内(-24℃X制作12-14微米厚的冰冻切片。用红色荧光标记EDZ,第一抗体是Anti-EDZuerotec,MCA342RX第二抗体是Texas red anti-mouse IgG Vector oomtories);用绿色荧光标记ca-thepsin D,第一抗体是 Anti-cathepsin D(Santa C。z Biotechnolo瓢,SC-6487),第 =抗体是 luorescein anti-goat IgG(Vector Laboratories,H-5000)。用 OLIMPUS AX80TR型显微镜观察,拍照。 5.免疫金电镜技术 在脑冠状切片上,将脑损伤部外侧2-4mm区域的大脑皮质切成小块,放人 4%多聚甲醛,0.25%戊二醛,0.二%单宁酸固定液中,经微波照射 20秒固定后,再浸泡固定4/J’时kt人按照Benyma。和Rodewald方法,用LR Gold树脂包埋。 超薄切片置于复盖有colloidion膜的镍网上,进行兔疫金标记。第一抗体是 Anti-cathepsin D(Santa C皿 Biotechnology,SC-6487),第二抗体是Blotlylated antlgoat IgG(Vector Laboratones,BA一 95000),15urn gold EMStreptavidin(BBInte*ational,40399)在室温下依次各孵育一小时,用金粒子标记CathePsin D。用醋酸双氧铀和拘椽酸铅轻度复染后,用JEM—2000EX型透射电镜观察,拍照,并进行定量分析。 结 果 1.辣根过氧化物酶反应 大鼠脑局部冻伤互小时,2小时和1天后,在直接冻伤的区域,血管被严重破坏,可见许多红细胞散在于脑组织内,并可见弥漫的HRP的蓝黑色反应产物。在此区域,脑组织被严重破坏,结构不清,也无法观察到结构清 ·二·楚的间藤细胞。而在脑损伤部外侧2-4mm区域的大脑皮质,组织结构清楚,血管(微动脉或微静脉)旁的间藤细胞,因吞入了大量的HRP,而清晰可见。这说明脑局部冻伤会引起血脑屏障破坏,静注的HRP从血管渗出,并被间藤细胞摄取。另外,在未损伤侧只见到少数的间藤细胞,摄取了小量的HRP,呈现沿血管长轴延伸的细长的形态。与未损伤侧相比较,可以看出,损伤侧的间藤细胞外形改变是变短变粗。在损伤一周后,在损伤侧再也见不到HRP的反应产物,这说明此时HRP已经停止从血管渗出。 2.透射电镜 在对照组,间藤细胞位于脑微血管平滑肌基底膜和星状胶质细胞的胶质膜之间。细胞质内有许多大型的高电子密度的包含体门nclusion body,IB入有时可见少量空泡或内吞小泡。在冻伤后10小时,在间藤细胞内,有的包含体电子密度降低,并出现蜂窝状包含体,在临近细胞膜的细胞质内可见吞饮小泡增加。在冻伤后2天,除了体积增大的包含体外,可见到许多小型的包含体,而且,蜂窝状包含体增多。也就是说,间藤细胞内包含体的数量增加;体积大的和体积小的空泡的数量都增加,因此细胞的体积增大。 3,免疫荧光双标记 在对照组,EDZ阳性反应存在于微血管旁,因EDZ为大鼠组织巨噬细胞的标志性抗原,常用来标识间藤细胞。所以,此EDZ阳性细胞为间藤细胞。同时,此细胞内可见到明显的CathePsin D阳性反应,这说明间藤细胞含有大量的 CathePsin D。在实验组,EDZ与C