论文部分内容阅读
1.研究目的：系统性红斑狼疮(SLE)是一种免疫功能紊乱的自身免疫性疾病,以多系统或器官病变和血清中出现多种自身抗体为特征,目前发病机制仍不明确。其中血液学损害为SLE的重要临床表现,其机制目前也并不十分清楚。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是骨髓微环境中具有多种分化倾向、高度增殖及自我更新能力的非造血性干细胞。能在特定条件下分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。BMSCs是造血微环境中的重要成分,不仅起支持作用,而且分泌细胞因子,调节造血细胞增殖分化。针对骨髓间充质干细胞的研究可能会揭示SLE的发病机理,解释血液学损害原因。细胞凋亡是维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡,是受到细胞内基因及细胞外一些因子调控的生物学过程。SLE患者BMSCs长期处于紊乱的骨髓微环境,其自身结构与功能也有一定缺陷。对于SLE患者BMSCs凋亡的研究有利于疾病机制的阐明,以及新疗法的探索。2.研究方法本试验共分为三组：①SLE患者BMSCs组(10人)；②其它结缔组织病患者BMSCs组(5人)；③正常人(对照组)BMSCs组(5人)。前二组患者均合并血液学损害,取骨髓标本前均未使用激素和免疫抑制剂治疗。所有SLE患者均符合美国风湿病学会1997年制定的分类诊断标准,SLEDAI评分≥10分,诊断为SLE活动期。对照组选择年龄与性别匹配,并排除自身免疫疾病的5名健康人。无菌操作下抽取骨髓液10ml,肝素抗凝,利用密度法分离单个核细胞,悬浮于成人骨髓间充质干细胞完全培养基后接种于培养皿,放置培养箱中。观察各组BMSCs的生长情况、细胞周期及凋亡情况。方法步骤如下：2.1BMSCs分离、纯化、传代及鉴定2.2取P3代BMSCs,用含成人骨髓间充质干细胞完全培养基重新悬浮细胞,进行培养。观察间充质干细胞的生物学变化：2.2.1绘制细胞生长曲线2.2.2流式细胞仪测定细胞周期2.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡3.统计学分析采用SPSS17.0软件对数据进行分析,采用单因素方差分析分析各组间细胞培养时间,细胞周期及凋亡差异的显著性,组间比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。4.研究结果4.1BMSCs可以黏附到培养皿底部生长,形态呈长梭形。待细胞融合达80%时可进行细胞传代。BMSCs表型为CD44、CD90和CD105阳性,而CD45、CD34为阴性。传代后BMSCs增殖迅速,生长周期缩短。多次(6次)传代后细胞表型不发生变化。系统性红斑狼疮组和其它结缔组织病组较对照组BMSCs原代培养所需时间更长(P<0.05)。传代后细胞生长旺盛,约5-7天可再次传代,三组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4.2BMSCs的细胞生物学变化的比较4.2.1分别对三组培养BMSCs绘制生长曲线,发现三组细胞的增长曲线基本相同,未见明显的差别；4.2.2通过流式细胞仪测定细胞周期,发现传代后的BMSCs处于相对静止状态和原始状态的细胞占绝大多数。进一步将三组BMSCs的S+G2/M期进行比较。发现SLE组和其它CTD组,二组比较差异无统计学意义(P>0.05)；但此两组明显高于对照组,差异存在统计学意义(P<0.05)。4.2.3通过流式细胞仪分别检测三组培养BMSCs的细胞凋亡。与正常对照组比,SLE组和其它结缔组织病组凋亡细胞数增多,具有统计学意义(P<0.05)。两组之间比较,未见明显差别(P>0.05)。5.研究结论SLE患者BMSCs在体外培养过程中凋亡增加,进一步证明SLE患者BMSCs本身存在缺陷。与其它结缔组织病对比,未见明显差别,推测自身免疫性疾病BMSCs的凋亡受到类似机制调控,均存在结构、功能上的缺陷,为BMSCs移植治疗自身免疫性疾病提供了理论依据。