血痕是法医物证中最常见的检材，也是法医物证检验中最常遇到和最重要的项目。目前常用的血痕检验的主要方法包括：生物化学方法、细胞学方法以及免疫学方法。这些方法都存在一定的局限性，如特异度不高、灵敏度较低、容易出现假阴或假阳性、不适合微量检材等。随着分子生物学技术的发展，越来越多的法医学研究者从基因表达水平探讨了血痕确证的新方法。　　 目的：　　 1.探讨并验证HBA和SPTB基因mRNA的组织特异性及其在法医血痕确证中的应用价值。　　 2.探讨并验证miR451和miR16基因的组织特异性及其在法医血痕确证中的应用价值。　　 3.建立基于目前法医DNA分析技术平台的血痕确证方法，并就其特异性、灵敏度及稳定性三个方面与抗人血红蛋白胶体金试纸进行比较。　　 方法：　　 1.RNA提取方法的研究：选取6个新鲜血痕样本，分别用TRIzol法和硅胶柱纯化法提取RNA，通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对提取的RNA定量和检测其完整性，选取适合本实验的RNA提取方法。并用Trizol法同时提取DNA，对DNA进行STR分型检测。　　 2.血痕HBA及SPTB mRNA的特异性研究：收集120份人静脉血样(新鲜血痕30份，陈旧血痕90份)，6种动物(狗、兔、小鼠、鸡、猫、猴)的血痕样本各1份，精液斑10份、月经血痕10份、阴道液斑10份。在NCBI Date Base上查找HBA、SPTB和ACTB的mRNA序列，利用Primer Express(R)2.0软件设计引物及TaqMan探针，并将设计好的引物序列导入BLAST软件，以检验引物的特异性。利用RT-qPCR法对所有样本检测其HBA和SPTB的△CT，并评估其在法医学上的应用价值。　　 3.血痕miR16及miR451microRNA的特异性研究：利用SPSS16.0统计分析软件对120份人静脉血痕进行随机抽样，选取60份为microRNA样本，利用RT-qPCR法对60份血痕、6种动物血、6份阴道液斑、6份精液斑检测其miR451和miR16的△CT，并评估其在法医学上的应用价值。　　 4.体液斑特异性mRNA标记的复合检测：对ACTB、HBA、MMP7、MMP11、KLK3和PRM2标记FAM荧光并建立复合扩增体系，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)-银染法和毛细管荧光电泳法检测特异性扩增片段。　　 5.抗人血红蛋白金标试纸的评估：用抗人血红蛋白金标试纸对不同动物血痕、陈旧血痕、逐级稀释的血液检测，并与HBA、SPTB、miR451和miR16比较。　　 结果：　　 1.RNA提取方法的选择：TRIzol法提取的RNA质量优于硅胶柱纯化法，对Trizol法同时提取DNA进行STR分型检测，可以得到理想的STR分型图谱。　　 2.血痕特异性mRNA标记检测体系：　　 (1)设定HBA阈值为0.2，阳性标准为ACTB CT≤35，HBACT≤38且△CT≤-5。对30份新鲜血痕进行检测，阳性率为97％。在10份阴道液和10份精液未见阳性，组织特异性好。HBA在6份动物血痕均可检测出CT值，但可以根据阳性标准与人血区分。在1μL血液或2ng的RNA模板均可检出HBA。对保存时间为3个月内的血痕CT值变化较大，6个月以上的血痕样本的CT值趋于稳定。　　 (2)设定SPTB阈值为0.05，阳性标准为ACTB CT≤35，SPTB CT≤40且4≤△CT≤13，对30份新鲜血痕进行检测，阳性率为60％。10份阴道液和10份精液假阳性率为30％。在动物血痕中未见阳性。对100μL血液或2ng的RNA模板均可检出SPTB。CT值在不同保存时间样本中变化较小，CT值介于39～41之间。　　 3.血痕特异性microRNA标记检测体系：　　 (1)设定miR16的阈值为0.2，阳性标准设为RNU6b CT≤40，miR16 CT≤35且△CT≤-13。对15份新鲜血痕进行检测，阳性率为73％；6份精液和6份阴道液中未见阳性检出，6种动物血中假阳性率为17％。对100μL血液或68ng的RNA模板均可检出miR16。在保存20年的血痕中仍有miR16表达。　　 (2)设定miR451的阂值设为0.2，阳性标准为RNU6b CT≤40，miR451 CT≤37且△CT≤-12。对15份新鲜血痕进行检测，阳性率为53％；6份精液和6份阴道液中未见阳性；6份动物血中假阳性率为33％。对100μL血液或68ng的RNA模板均可检出miR451。在保存20年的血痕中仍有miR451表达。　　 4.体液斑复合扩增体系：以HBA mRNA为血痕特异性标记，与精液和月经血的特异性mRNA标记和内参基因mRNA标记进行复合检测。在不同体液斑的特异性片段扩增产物位置有相应产物，组织特异性好。猴血中可以检测到HBA和ACTB扩增片段，其他动物血中均无HBA和ACTB扩增片段检出。设HBA的RFUs值＞200为阳性，单独扩增时HBA在1×10-4μL血液和2×10-2ng RNA中仍可检测到扩增片段并达到阳性标准；复合扩增时在1μL血液和20ng的RNA模板均可检出HBA。在保存3个月内的血痕中检出HBA。　　 5.抗人血红蛋白胶体金试纸的结果：猴血抗人血红蛋白胶体金试纸试验呈阳性反应。可检测到的最低血液浓度为1×10-4μL。对于10年内的陈旧血痕可呈阳性反应。　　 结论：　　 1.HBA可作为血痕特异性mRNA标记用于血痕确证，但不适用于常温下保存时间超过3个月的血痕确证。　　 2.SPTB种属特异性低、组织特异性低及在血痕中含量不稳定的缺点，不建议将SPTB作为血痕特异性mRN A标记用于血痕确证。　　 3.miR16和miR451可作为血痕特异性microRNA标记用于血痕确证。　　 4.毛细管荧光电泳通过检测复合扩增产物可以同时检测多种体液斑，是基于现有DNA分型技术确证体液斑的有效方法。　　 5.HBA、miR16和miR451可联合用于陈旧血痕的确证。　　 6.抗人血红蛋白胶体金试纸在猴血呈阳性结果，在灵敏度、对陈旧血痕的确证方面优于HBA和SPTB。