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血痕是法医物证中最常见的检材,也是法医物证检验中最常遇到和最重要的项目。目前常用的血痕检验的主要方法包括:生物化学方法、细胞学方法以及免疫学方法。这些方法都存在一定的局限性,如特异度不高、灵敏度较低、容易出现假阴或假阳性、不适合微量检材等。随着分子生物学技术的发展,越来越多的法医学研究者从基因表达水平探讨了血痕确证的新方法。
目的:
1.探讨并验证HBA和SPTB基因mRNA的组织特异性及其在法医血痕确证中的应用价值。
2.探讨并验证miR451和miR16基因的组织特异性及其在法医血痕确证中的应用价值。
3.建立基于目前法医DNA分析技术平台的血痕确证方法,并就其特异性、灵敏度及稳定性三个方面与抗人血红蛋白胶体金试纸进行比较。
方法:
1.RNA提取方法的研究:选取6个新鲜血痕样本,分别用TRIzol法和硅胶柱纯化法提取RNA,通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对提取的RNA定量和检测其完整性,选取适合本实验的RNA提取方法。并用Trizol法同时提取DNA,对DNA进行STR分型检测。
2.血痕HBA及SPTB mRNA的特异性研究:收集120份人静脉血样(新鲜血痕30份,陈旧血痕90份),6种动物(狗、兔、小鼠、鸡、猫、猴)的血痕样本各1份,精液斑10份、月经血痕10份、阴道液斑10份。在NCBI Date Base上查找HBA、SPTB和ACTB的mRNA序列,利用Primer Express(R)2.0软件设计引物及TaqMan探针,并将设计好的引物序列导入BLAST软件,以检验引物的特异性。利用RT-qPCR法对所有样本检测其HBA和SPTB的△CT,并评估其在法医学上的应用价值。
3.血痕miR16及miR451microRNA的特异性研究:利用SPSS16.0统计分析软件对120份人静脉血痕进行随机抽样,选取60份为microRNA样本,利用RT-qPCR法对60份血痕、6种动物血、6份阴道液斑、6份精液斑检测其miR451和miR16的△CT,并评估其在法医学上的应用价值。
4.体液斑特异性mRNA标记的复合检测:对ACTB、HBA、MMP7、MMP11、KLK3和PRM2标记FAM荧光并建立复合扩增体系,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)-银染法和毛细管荧光电泳法检测特异性扩增片段。
5.抗人血红蛋白金标试纸的评估:用抗人血红蛋白金标试纸对不同动物血痕、陈旧血痕、逐级稀释的血液检测,并与HBA、SPTB、miR451和miR16比较。
结果:
1.RNA提取方法的选择:TRIzol法提取的RNA质量优于硅胶柱纯化法,对Trizol法同时提取DNA进行STR分型检测,可以得到理想的STR分型图谱。
2.血痕特异性mRNA标记检测体系:
(1)设定HBA阈值为0.2,阳性标准为ACTB CT≤35,HBACT≤38且△CT≤-5。对30份新鲜血痕进行检测,阳性率为97%。在10份阴道液和10份精液未见阳性,组织特异性好。HBA在6份动物血痕均可检测出CT值,但可以根据阳性标准与人血区分。在1μL血液或2ng的RNA模板均可检出HBA。对保存时间为3个月内的血痕CT值变化较大,6个月以上的血痕样本的CT值趋于稳定。
(2)设定SPTB阈值为0.05,阳性标准为ACTB CT≤35,SPTB CT≤40且4≤△CT≤13,对30份新鲜血痕进行检测,阳性率为60%。10份阴道液和10份精液假阳性率为30%。在动物血痕中未见阳性。对100μL血液或2ng的RNA模板均可检出SPTB。CT值在不同保存时间样本中变化较小,CT值介于39~41之间。
3.血痕特异性microRNA标记检测体系:
(1)设定miR16的阈值为0.2,阳性标准设为RNU6b CT≤40,miR16 CT≤35且△CT≤-13。对15份新鲜血痕进行检测,阳性率为73%;6份精液和6份阴道液中未见阳性检出,6种动物血中假阳性率为17%。对100μL血液或68ng的RNA模板均可检出miR16。在保存20年的血痕中仍有miR16表达。
(2)设定miR451的阂值设为0.2,阳性标准为RNU6b CT≤40,miR451 CT≤37且△CT≤-12。对15份新鲜血痕进行检测,阳性率为53%;6份精液和6份阴道液中未见阳性;6份动物血中假阳性率为33%。对100μL血液或68ng的RNA模板均可检出miR451。在保存20年的血痕中仍有miR451表达。
4.体液斑复合扩增体系:以HBA mRNA为血痕特异性标记,与精液和月经血的特异性mRNA标记和内参基因mRNA标记进行复合检测。在不同体液斑的特异性片段扩增产物位置有相应产物,组织特异性好。猴血中可以检测到HBA和ACTB扩增片段,其他动物血中均无HBA和ACTB扩增片段检出。设HBA的RFUs值>200为阳性,单独扩增时HBA在1×10-4μL血液和2×10-2ng RNA中仍可检测到扩增片段并达到阳性标准;复合扩增时在1μL血液和20ng的RNA模板均可检出HBA。在保存3个月内的血痕中检出HBA。
5.抗人血红蛋白胶体金试纸的结果:猴血抗人血红蛋白胶体金试纸试验呈阳性反应。可检测到的最低血液浓度为1×10-4μL。对于10年内的陈旧血痕可呈阳性反应。
结论:
1.HBA可作为血痕特异性mRNA标记用于血痕确证,但不适用于常温下保存时间超过3个月的血痕确证。
2.SPTB种属特异性低、组织特异性低及在血痕中含量不稳定的缺点,不建议将SPTB作为血痕特异性mRN A标记用于血痕确证。
3.miR16和miR451可作为血痕特异性microRNA标记用于血痕确证。
4.毛细管荧光电泳通过检测复合扩增产物可以同时检测多种体液斑,是基于现有DNA分型技术确证体液斑的有效方法。
5.HBA、miR16和miR451可联合用于陈旧血痕的确证。
6.抗人血红蛋白胶体金试纸在猴血呈阳性结果,在灵敏度、对陈旧血痕的确证方面优于HBA和SPTB。