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真姬菇（Hypsizygusmarmoreus）是一种珍稀食用菌，属于中偏低温型食用菌。菌丝生长温度5～30℃，最适20～25℃，超过35℃或低于4℃时菌丝不再生长，在45℃以上无法存活，温度过高或过低都会对真姬菇的生产造成较大影响。因此，真姬菇新品种（高抗菌株）培育成为真姬菇生产和科研中的一个重要课题。热激蛋白(heatshockprotein，HSP)是一类在有机体受到高温等逆境刺激后大量表达的蛋白，是生物对逆境胁迫短期适应的必需组成成分，对减轻逆境胁迫引起的伤害有很大的作用。热激蛋白一旦在体内形成，生物体就会尽快地适应外界环境，表现出很强的抗逆性。因此，热激蛋白基因是育种工作中具有重要实用价值的优良基因。
在本实验室已经成功克隆出Hsp70基因（GenBank登录号为GQ246176，全长共2308bp，开放性阅读框共2001bp，编码666个氨基酸）的基础上，本项研究构建了Hsp70基因的真姬菇表达载体PHspHyg;然后将Hsp70基因转入真姬菇基因组中，成功获得了转Hsp70基因真姬菇菌株，并检测出Hsp70基因在真姬菇中的高效表达。主要研究成果如下:
1.以质粒pROK2为出发质粒，通过PCR扩增出完整的Hsp70基因，并在其两侧加上KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点，回收该片段后，将其插入质粒pROK2的多克隆位点处，获得重组质粒PHsp;然后在此基础上，限制性内切酶HindⅢ和NheⅠ双酶切重组质粒PHsp，回收质粒大片段，通过PCR将质粒pCAMBIA1301中的Hyg表达框完整扩增出来，并在其两侧加上HindⅢ和NheⅠ酶切位点，回收该片段后，与酶切后质粒PHsp的大片段相连接，获得重组质粒PHspHyg。成功构建了Hsp70基因的真姬菇表达载体。
2.通过对真姬菇的潮霉素抗性试验，确定了真姬菇G12的潮霉素致死浓度应该在20μg/ml左右，据此将农杆菌转化的初筛浓度定为20μg/ml，复筛浓度定为25μg/ml。通过Cefotaxime对真姬菇的毒性试验，结果表明，Cefotaxime对真姬菇G12的菌丝生长基本没有影响，从而确定了Cef的最佳抑菌浓度为200μg/ml。
3.本实验采取农杆菌介导的方法将Hsp70基因真姬菇表达载体PHspHyg转入真姬菇G12中，使得Hsp70基因表达框整合到真姬菇的基因组DNA中。通过对潮霉素抗性转化子的验证，证明成功获得了转Hsp70基因真姬菇菌株。
4.通过对已经成功获得的真姬菇转化子菌丝，进行45℃高温不同时间的热激处理试验，结果表明，真姬菇转化子的菌丝对高温热激处理比真姬菇对照组的菌丝有较好的耐热性;SDS-PAGE电泳检测高温热激处理后的真姬菇转化子的菌丝蛋白，结果表明真姬菇转化子的蛋白在90KDa的表达量要大于对照组真姬菇，结果与我们预计的一样。说明我们构建的真姬菇转化子可以提高热激蛋白的表达量，增强真姬菇对高温的应激性。
本试验研究结果对通过分子生物学技术提高食用菌对高温的应激性提供了良好的思路，对农业栽培食用菌与现代生物学技术相结合应用有更好的前景。