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恶性淋巴瘤发病的分子机制是当前肿瘤研究的热点。恶性淋巴瘤作为我国常见恶性肿瘤之一,从分子病理学和分子遗传学水平来探讨其相关基因的特征和发病机制,以期建立相应的分子标记,进一步协助诊断、判断预后、并为进一步的预防提供新思路,已成为目前国内外淋巴瘤研究的主要方向。
免疫球蛋白重链(IgH)基因是成熟B细胞正常表达的基因。在正常淋巴细胞的发育过程中,IgH基因的4个分离的编码序列,即可变区(V)、多变区(D)、连接区(J)和恒定区(C)会发生随机重排组合成一个有结构的基因。组合后的IgH基因主要包括三个框架区(FRs)和三个互补决定区(CDRs)。IgH基因的重排形式是淋巴瘤最重要的辅助诊断之一,而且其重链可变区(IgVH)的突变状态可反映B细胞肿瘤的起始来源,进一步的研究发现IgVH基因的突变状态与某些淋巴瘤的恶性程度及预后相关。
在生发中心的发育过程中,遭遇抗原的识别主要发生在互补决定区,发生体细胞超突变(SHM)。在此期间,Ig基因的V段产生高频点突变,致使B细胞产生高亲合力的IG分子。这个过程易受内、外因素(如个体遗传差异、病毒感染等)干扰而出现差异,构成了淋巴瘤发生的重要高危因素。SHM是B细胞发展阶段的一个重要标志,目前认为Ig的SHM是细胞来源于生发中心的标记。IgVH基因的SHM分析使得人们对B细胞和其恶性肿瘤的发展过程以及一些B细胞肿瘤的亚型有了更深刻的了解。研究还发现不同的淋巴瘤所使用的VH基团家族存在着差别,有的淋巴瘤对特定的VH基因家族有着特殊的偏好,即所谓的VH基因偏向性使用,这一分子遗传学上的特征在淋巴瘤发病中的意义也值得深入研究。
近年来国外学者利用基因扫描(Genescan)技术,可精准分析IgVH基因的克隆重排状态,归纳重排类型,比常规PCR琼脂糖凝胶电泳检测更加精确,国外已经将它作为分子病理诊断的常规项目。目前国内尚开展的较少,本研究将对PCR基础上的基因扫描技术在淋巴瘤诊断中的应用进行探讨。
我们采用通用引物FR3A和FR2A,检测了70例常见类型的B-NHL(主要包括DLBCL、MALT、FL、MCL及CLL)的IgVH基因克隆重排,其中63例用FR3A引物检测阳性,阳性率90.0％;38例用FR2A引物检测阳性,阳性率54.3％;65例用FR3A或者FR2A引物检测阳性,阳性率92.9％。
基因扫描可以快速有效地区分相同或不同克隆的PCR产物。我们用荧光染料标记上游引物(或下游引物),采用DNA分析仪以及GeneMapper软件(GeneMapper3.1,ABI)对PCR产物进行分析。在研究中我们发现,琼脂糖凝胶电泳下显示为单条条带的病例经基因扫描检测后,单克隆重排及双克隆重排检出率只有70％左右。通过对琼脂糖凝胶电泳与基因扫描检测的结果进行比较,我们发现琼脂糖电泳检测为单条条带的病例,基因扫描检测结果并不为单克隆重排,以FR3A为例,其中双克隆重排6例,寡克隆重排3例,多克隆重排3例;而作为对照的慢性扁桃炎有时在凝胶电泳下也为单条条带,经基因扫描检测后明确了其多克隆重排的特征。这一结果说明常规的琼脂糖凝胶电泳技术检测重排不能用于判断淋巴瘤的克隆重排类型。而PCR基础上的基因扫描技术能够弥补这一缺陷,成为淋巴瘤分子诊断的重要手段。在国外它已经被作为淋巴瘤诊断的常规检测方法,而国内尚有待开展。
我们把FR2A阳性的DLBCL病例进行测序,将测序结果和IgBLAST数据库上的序列比对分析,进一步探讨DLBCL中IgVH基因的分子特征。本研究中测序成功17例DLBCL(17/52),免疫组化结果显示3例为生发中心型DLBCL,其余14例均为非生发中心型DLBCL,测序结果显示它们都携带突变型IgVH基因,都为生发中心或生发中心后的DLBCL,主要表现为核苷酸的替换。
目前对DLBCL中VH基因的偏向性使用还存在着争议,Lossos等人对53例VH片段的偏向性分析发现DLBCL所携带的VH基因家族比率与正常血液中的B细胞相似。而也有相反的报道认为DLBCL中有VH4-34的偏向性使用。本研究测序成功的17例DLBCL中,3例双克隆样本的VH片段都来自VH3和VH4家族,其余样本中,7例使用VH4家族(且VH4-34和VH4-61出现的频率最高),6例使用VH3家族。此小样本研究显示DLBCL倾向使用VH4和VH3家族,还需要扩大样本进行统计。
综上所述,我们利用PCR凝胶电泳结合基因扫描技术检测B-NHL中IgVH基因的克隆性重排,显示PCR基础上的基因扫描技术能够用于B细胞淋巴瘤IgVH基因的重排类型,是淋巴瘤的分子诊断的重要手段。此外,我们结合免疫组化,进行IgVH基因的序列分析有助于确定B细胞肿瘤的来源,判断它们是生发中心前来源还是生发中心或生发中心后来源的B细胞淋巴瘤。同时我们对DLBCL使用的VH片段进行分析发现其主要倾向使用VH4和VH3家族。体细胞超突变和VH偏向性可能会影到DLBCL患者的临床进程和存活期,也可能与DLBCL发病的分子机制有关。