研究背景：　　肺癌和乳腺癌分别是男性和女性中发病率最高的癌症，同时也分别是男性和女性中肿瘤相关死亡的主要原因。近年来，虽然肺癌和乳腺癌发病机制的基础研究取得了重大进展，而且相应的临床治疗技术例如：手术、化疗等也日益完善，但患者的生存预后仍不理想。同源盒基因是一类在进化上高度保守，同时又具有多样性的基因家族，该基因家族保守序列编码能够结合DNA的同源结构域蛋白，并参与了包括个体胚胎、组织和器官的发育过程以及包括肿瘤在内多种疾病的发生。本课题组前期研究发现了两个在肺癌和乳腺癌中均表达显著下调的同源盒家族转录因子：LHX6和ALX4，但它们在肺癌和乳腺癌中的主要临床预后意义以及在肿瘤发生中的功能和作用机制和均不清楚。为此，本研究首先分析LHX6和ALX4与肺癌和乳腺癌患者生存预后以及临床参数的关系，并进一步对LHX6和ALX4在肿瘤发生中的主要功能及作用机制进行了较为系统的研究。　　研究内容：　　1. LHX6和ALX4与肺癌和乳腺癌患者生存预后的探究　　构建组织芯片并利用免疫组织化学方法分析了肿瘤组织中LHX6和ALX4基因的表达，结合公共数据（www.kmplot.com/analysis 和 https://genome-cancer.soe.ucsc.edu）中 LHX6 和 ALX4 基因在肺癌与乳腺癌中的表达数据，使用 Kaplan-Meier 法和Cox-Regression法分析了LHX6和ALX4与肺癌和乳腺癌患者生存预后的关系。　　2. LHX6和ALX4分别在肺腺癌和乳腺癌中的表达及与临床进展的探究　　通过RT-PCR、qPCR、WB、IHC和生物信息学方法检测LHX6在肺腺癌组织和肺癌细胞系，以及ALX4在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中的表达情况，并进一步分析基因表达与其它临床参数的关系。　　3. LHX6在肺腺癌中的表达调控模式、功能和作用机制的研究　　使用 MSP、去甲基化药物处理细胞基因表达恢复实验和肿瘤数据库（www.cbioportal.com）分析了LHX6在肺腺癌中的甲基化与表达的关系。通过体外MTS、克隆形成、Transwell实验和体内裸鼠成瘤实验探究LHX6在肺腺癌细胞系中的功能。使用 PI 单染法检测 LHX6 对细胞周期的影响。通过 qPCR、WB 和 TOP/FOP Flash 分析Wnt/β-catenin 信号通路的改变，构建含有不同区段 CTNNB1 启动子的荧光素酶报告基因载体，分析 LHX6 对其转录活性的影响。最后通过 TCGA 数据库进一步验证上述结果。　　4. ALX4在乳腺癌中的表达调控模式、功能和作用机制的研究　　使用MSP和BSP方法检测了8例正常乳腺组织、3株乳腺癌细胞系和108例乳腺癌患者组织中ALX4基因启动子的甲基化状态。使用去甲基化药物5-aza-dc处理乳腺癌细胞，并使用公共数据库数据分析，探究ALX4的表达与启动子甲基化关系。　　进一步通过体外MTS、克隆形成、EDU实验、Transwell实验和体内裸鼠成瘤实验探究ALX4在乳腺癌细胞中的功能，使用V-APC/7-AAD双染法和PI单染法检测ALX4对细胞凋亡和细胞周期的影响。通过生物信息学、qPCR、WB 和 TOP/FOP Flash 分析Wnt/β-catenin信号通路的改变，通过荧光素酶报告基因分析ALX4对β-catenin的转录调控。　　研究结果：　　1. LHX6和ALX4分别是肺腺癌和乳腺癌患者预后良好的标志物　　Kaplan-Meier法分析显示，LHX6在肺腺癌患者中是一个预后良好的标志物（N =720，P=0.00），但与乳腺癌患者的生存预后无显著相关性（N=1402，P=0.24）；ALX4在乳腺癌患者中是一个预后良好的标志物（N=1080，P=0.00），但与肺癌患者的生存预后无显著相关性（N=997，P=0.67）。通过构建组织芯片，使用Cox-regression分析进一步证实LHX6是肺腺癌患者预后良好的独立标志物（N=88，P=0.01）；ALX4是乳腺癌患者预后良好的独立标志物（N=142，P=0.01）。　　2. LHX6和ALX4分别在肺腺癌和乳腺癌中低表达，且与临床进展显著相关　　表达分析显示，LHX6在肺腺癌组织和肺癌细胞系中低表达；ALX4在乳腺癌组织和细胞系中呈现低表达状态。进一步分析发现LHX6的表达与肺腺癌患者病理分级（N=88，P=0.00）、肿瘤大小（N=88，P=0.02）和淋巴结状态（N=84，P=0.03）显著相关；ALX4的表达与临床分期（N=140，P=0.03）、肿瘤大小（N=141，P=0.01）和淋巴结状态（N=138，P=0.00）显著相关，同时其表达可以作为区分正常和乳腺癌患者灵敏和特异的生物标志物（Area under the curve=0.874，P<0.01，95%Cl=0.84-0.90）。　　3. LHX6 在肺腺癌中由于启动子区甲基化调控表达下调；LHX6 通过转录抑制β-catenin的表达，干扰Wnt/β-catenin通路，抑制肺腺癌细胞增殖转移　　DNA甲基化检测和数据库分析发现，在肺腺癌中LHX6基因发生明显的甲基化，且其表达受其启动子甲基化负调控。利用 MTS、克隆形成、裸鼠移植瘤实验等方法发现LHX6在体内外均能够抑制肺腺癌细胞的增殖和侵袭转移，并通过诱导G1/S期阻滞抑制肺腺癌细胞增殖。机制分析发现，LHX6主要通过转录抑制β-catenin的表达，并进一步抑制Wnt/β-catenin下游信号通路抑制肿瘤生长和转移。β-catenin启动子（-1161bp 至+27bp）区域是LHX6发挥抑制功能的关键序列。　　4. ALX4在乳腺癌中表达受甲基化负调控；ALX4通过促进β-catenin蛋白水平的磷酸化降解，干扰Wnt/β-catenin通路，抑制乳腺癌细胞增殖转移　　甲基化检测发现，ALX4基因启动子区域在3株乳腺癌细胞系和108例乳腺癌患者组织中均呈现高甲基化状态，而8例正常乳腺组织中均未检测到甲基化。去甲基化处理后发现ALX4恢复表达，进一步分析发现A LX4表达与其启动子甲基化程度呈显著负相关（P<0.01）。　　体外和体内功能分析发现，ALX4通过诱导乳腺癌细胞的凋亡和G1/S期阻滞抑制肿瘤增殖；同时，ALX4能够显著抑制乳腺癌细胞的侵袭转移。分子机制研究发现，ALX4并不能在转录水平调控β-catenin表达，但能够诱导GSK3β促进β-catenin蛋白水平的磷酸化降解，干扰Wnt/β-catenin信号通路，进而发挥抑癌功能。　　研究结论：　　综上所述，我们的研究揭示LHX6和ALX4是重要的肿瘤预后候选标志物和肿瘤抑制基因，并分别通过转录抑制和蛋白磷酸化降解两个水平调控 β-catenin ，干扰Wnt/β-catenin信号通路，发挥抑癌作用。本研究不仅丰富了我们对肺腺癌和乳腺癌发生机制的认识，也为以后深入研究LHX6和ALX4在其它癌症中的机制提供新的线索。