研究背景胃癌的发生与发展涉及多因素、多阶段,在此过程中,趋化因子受体(chemokine receptor)作为肿瘤发生侵袭和转移的有利工具,对肿瘤的恶性行为起着关键作用。趋化因子受体是具有7次跨膜结构域的G蛋白偶联受体超家族成员,可表达在不同类型的细胞上。胃肿瘤细胞能表达不同的趋化因子受体,如CXCR4和CCR7,并通过这些分子发生转移。近期研究发现,胃癌细胞表达CC型趋化因子受体—CCR4,并与胃癌转移及患者预后有关,但调控其表达的关键因子及具体机制不明。以往研究显示,CCR4选择性地表达在Th2型细胞及Treg细胞上,对于调节免疫平衡或抑制肿瘤免疫具有重要作用；CCR4阳性的成人T细胞白血病/淋巴瘤细胞,因具有Treg细胞样的功能而能够逃逸宿主免疫。虽然这些研究显示了CCR4具有与免疫抑制相关的功能,但其研究角度一般是从该受体的趋化活性出发,且主要聚焦于免疫细胞或非实体肿瘤细胞,而关于CCR4在实体肿瘤细胞上表达的研究数据比较有限,并且CCR4自身是否具有免疫调节的功能未知。另一方面,某些研究提示,肿瘤细胞不仅借助于趋化因子受体及相应配体的相互作用获得趋化活性而进行迁移,还可以通过该途径上调基质金属蛋白酶的活性而进行侵袭,目前尚无关于CCR4与肿瘤侵袭能力相互关系方面的研究。在本研究中,我们选取胃癌临床标本、采用胃癌细胞系及建立细胞共培养体系,分别通过IHC(免疫组化)、IHF(免疫组织荧光)、基因转染、实时定量RT-PCR、FCM(流式细胞术)、悬浮芯片、侵袭实验的方法,从明确CCR4在胃癌细胞中表达的调节因素及分析其参与肿瘤免疫调节、肿瘤侵袭作用的新视角,揭示CCR4在胃癌中表达的调控机制及相关生物学功能,为阐释趋化因子受体相关的肿瘤进展机制及寻找胃癌临床治疗新靶点提供重要数据和理论依据。目的：分别检测CCR4在胃不典型增生组织、胃癌和配对的癌旁组织、淋巴结转移灶及胃癌细胞系中的表达,分析CCR4的表达分布特点及其在胃癌中的表达调节因素和调控机制。方法：1.选用石蜡包埋的临床组织标本,包括胃不典型增生组织56例,胃癌和相应癌旁组织各63例,及配对的淋巴结转移胃癌42例,通过IHC检测分析CCR4的表达分布特点及其与临床病理参数的相关性；同时检测胃癌组织中TNF-α的表达,分析CCR4与TNF-α在胃癌中表达的相关性。2.采用实时定量RT-PCR、FCM检测CCR4在胃癌细胞系MKN-28(高分化)、SGC-7901(中分化)、AGS(中分化)、MKN-45(低分化)中的表达。3.通过采用不同细胞因子(MCP-1、OPN、CCL22、TNF-α)刺激的方法,观察CCR4表达的调控因素；及通过加信号通路抑制剂的方式研究CCR4表达的调控机制。结果：1.IHC结果显示,CCR4在胃癌组织中的阳性率(27/63；42.9%)显著高于癌旁(0/63；0)及胃不典型增生组织(2/56；3.6%)(P均<0.001)；肿瘤原发部位组织中CCR4的阳性率(15/42；35.7%)显著低于淋巴结转移灶(35/42；83.3%)(P<0.01)；胃癌组织中CCR4的表达与TNF-α成正比(P<0.05)。2.实时定量RT-PCR检测结果显示,四种胃癌细胞系间CCR4mRNA的表达无显著差异(P均>0.05)：流式细胞术结果显示,胃癌细胞系中CCR4蛋白均处于低表达状态,无统计学差异(P均>0.05)。3.细胞因子刺激实验显示,TNF-α可通过NF-κB信号途径以剂量依赖方式上调胃癌细胞中CCR4的表达。结论：1.CCR4在癌旁胃正常粘膜中不表达,在胃不典型增生组织中开始出现弱阳性,在胃癌组织中呈现高表达,在胃癌淋巴结转移灶中出现更高的阳性表达率,可见随着胃肿瘤的发生及恶性演进,CCR4的表达出现逐渐增高的趋势。2.CCR4在胃癌细胞中的表达和分化程度无关,胃癌细胞本身不能组成性高表达CCR4,而是由肿瘤微环境中的某些因素(如TNF-α炎症刺激)所诱导表达,并受到NF-κB信号通路的调控作用。3.以往研究报道CCR4在胃癌中表达,本研究则通过对比分析不同来源的胃组织标本中CCR4的表达分布特征,及采用细胞系的细胞因子刺激实验,进一步明确了CCR4在胃癌细胞中的表达特点及其表达的相关调控机制,国内外均未见报道。目的：分析淋巴细胞丰富的胃癌及常见胃癌两组间CCR4表达的差异,并通过建立体外共培养体系,观察胃癌细胞高表达CCR4对肿瘤免疫的调节作用。方法：1.通过IHC分析CCR4在淋巴细胞丰富的胃癌和常见胃癌两组间的差异表达；2.应用SGC-7901胃癌细胞系,通过体外脂质体瞬时转染的方法使其过表达带EGFP的CCR4,通过实时定量RT-PCR、荧光显微镜观察及FCM分别检测转染效率,获得高表达CCR4的胃癌细胞模型,并与通过Ficoll分离获得的人外周血单个核细胞(PBMC)建立共培养体系；3.采用FCM及悬浮芯片分别观察SGC-7901细胞系过表达CCR4后对共培养体系中细胞因子及GrA(颗粒酶A)、GrB、穿孔素产生的影响。结果：1.IHC结果显示,CCR4在淋巴细胞丰富的胃癌中的表达阳性率显著高于常见胃癌(P<0.05),并伴有与Th2型免疫反应有关的生发中心形成现象发生；2.实时定量RT-PCR、荧光显微镜观察及FCM均证实获得瞬时高表达CCR4的细胞模型。所建立的共培养体系中,PBMC+CCR4组IFN-γ的分泌水平较PBMC+MOCK对照组(P<0.01)及PBMC+CCR4+复合物39组(P<0.05)显著降低,而IL-10的分泌水平较其他两组显著升高(P均<0.01)；同时,PBMC+CCR4组的CD56+NK表达GrzA的水平较PBMC+MOCK和PBMC+CCR4+复合物39两组显著降低(P均<0.05),而GrzB和穿孔素的水平未见组间差异。结论：1.胃癌细胞异常高表达CCR4可负向调控抗肿瘤免疫反应,调节细胞因子的分泌向Th2型偏移,并抑制免疫细胞毒效应分子的分泌。2.与以往报道的由CCR4趋化性间接引起的免疫抑制不同,本研究证实了CCR4自身所具有的肿瘤免疫调控功能,为CCR4作为胃癌潜在免疫治疗靶点的可能性提供了重要数据支持。目的：本研究旨在通过观察CCR4在无淋巴结转移的胃癌患者(pN0)肿瘤组织中的表达特点,分析CCR4与肿瘤侵袭性的关系,并在细胞系中进行验证及进一步阐释CCR4介导的肿瘤侵袭机制。方法：1.选取pN0的胃癌病人70例,采用IHC及IHF方法检测肿瘤标本中CCR4的表达,并进行临床病理参数相关性分析；2.应用SGC-7901、BGC-823胃癌细胞系,通过体外脂质体瞬时转染MOCK对照质粒或EGFP-CCR4质粒载体,通过实时定量RT-PCR、荧光显微镜观察及FCM分别检测转染效率；3.采用侵袭试验,观察SGC-7901细胞系过表达CCR4后对胃癌细胞侵袭能力的影响；4.分别通过实时定量RT-PCR及明胶酶谱实验检测胃癌细胞系过表达CCR4后对MMP9基因及蛋白水平表达的影响。结果：1.IHC及IHF显示,CCR4在pN0胃癌病人肿瘤组织中具有两种表达模式,分化较好的胃癌细胞为胞膜和胞浆同时存在(M+C型)为主,分化较差的胃癌细胞表达模式以胞浆型(C型)为主,具有侵袭行为的肿瘤细胞CCR4表达模式表现为C型。CCR4的表达与pN0胃癌患者T分期呈正相关(P<0.05)；2.实时定量RT-PCR.荧光显微镜观察及FCM均证实转染效率较高。体外侵袭实验表明,胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823过表达CCR4后,在不依赖外源性配体刺激的条件下侵袭能力较MOCK对照组显著增加(P<0.05)3.实时定量RT-PCR及明胶酶谱实验分别显示,在有无或外源性配体刺激条件下,与MOCK对照组相比,CCR4均能显著上调SGC-7901和BGC-823细胞MMP9基因表达水平(P<0.05)及明显增加MMP9蛋白分泌。结论：1.pN0患者胃癌细胞的浸润侵袭行为与CCR4的表达呈正相关,且表现为高侵袭性的胃癌细胞中CCR4表达模式为C型,提示胃癌细胞可通过CCR4以配体非依赖方式提高肿瘤侵袭能力。目前国内外研究中缺乏无淋巴结转移的肿瘤中相关趋化因子受体功能的数据,本研究则为明确参与pN0胃癌患者疾病进展的相关分子,提供了重要实验证据。2.研究证实CCR4受体途径能够上调MMP9表达,这为阐释CCR4介导的胃癌细胞相关侵袭机制提供了重要依据。国内外未见CCR4介导肿瘤侵袭的其他研究报道。