论文部分内容阅读
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(Phosphoenolpyruvatecarboxykinase1，PCK1)，也叫胞质型磷酸烯醇式丙酮酸（PEPCK-C），是一个与糖原异生、甘油异生、生殖和雌性动物繁殖力、肥胖和糖尿病有关多功能基因，最新的研究表明转PCK1基因小鼠的繁殖力和繁殖年限与普通小鼠相比明显增高。为了研究该基因是否对牛产生同样的效果，本论文通过可变剪接体的鉴定与表达分析、核心启动子区域的确定、MicroRNA靶标及功能验证三个方面分别对PCK1基因的表达与分子调控机制进行了初步研究，试验分以下三部分：1.牛PCK1基因可变剪接体的鉴定与表达分析通过对筛选的中国荷斯坦公母牛的9种不同组织（心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、睾丸、卵巢、精子）cDNA进行PCK1基因mRNA表达分析及其剪接异构体试验发现：在骨骼肌和精子中未检测到PCK1mRNA的表达；在心、脾和肺组织中表达量很低；PCK1mRNA在肝、肾、卵巢和睾丸组织中高表达。利用RT-PCR和克隆测序技术检测到5种新的剪接异构体，分别命名为PCK1-AS1~PCK1-AS5。同完整转录本所编码的蛋白（622AA）相比，这些新检测到的剪接体预计编码蛋白的长度均要短一些（分别为605AA,546AA,373AA,246AA和274AA），PCK1-AS1~PCK1-AS5剪接异构体存在着不同程度的功能性结构域的缺少或丢失，导致其编码PCK1基因相关功能的减弱或丧失。2.牛PCK1基因启动子的克隆及活性鉴定为了研究牛PCK1基因表达调控的分子机制，本试验对牛PCK1基因利用相关在线软件进行了启动子区域预测，并在实验室成功构建了具有不同长度的缺失片段的一系列表达载体，瞬时转染HepG2细胞。利用双荧光素酶报告基因检测系统，对牛PCK1基因上游非编码区序列不同长度片段的启动子活性进行研究，寻找其核心启动子区域。最终确定牛PCK1基因启动子的核心序列为g.-785~g.-462。此试验为研究PCK1基因在转录后水平的调控的分子机制奠定了基础。3.牛PCK1基因靶标microRNAs的表达分析利用RT-PCR和克隆测序技术，本试验对牛PCK1基因3-UTR区域进行分析，结果显示：在牛PCK1mRNA3-UTR区域检测到两个SNP位点：SNP1（m.+2108G>A）和SNP2（m.+2183G>T）。利用靶标microRNA预测软件分析两个SNPs位点突变前后靶microRNA结合情况。分析显示，SNP2在突变前后，bta-miR-26a种子区与PCK1基因3-UTR的结合情况不同。通过荧光素酶检测发现在HepG2细胞中PCK1基因的表达受bta-miR-26a的调控：与SNP2突变前基因型（GG）相比，bta-miR-26a可显著降低SNP2突变后基因型（TT）PCK1基因在HepG2细胞中的表达（p=0.01）。该SNP通过改变bta-miR-26a和PCK1基因3’侧翼区的靶标结合来影响PCK1基因的表达从而可能造成奶牛繁殖性能方面的差异。bta-miR-26a显著抑制突变后PCK1基因的表达，该突变位点可作为奶牛繁殖性状潜在的功能性分子标记。