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流感病毒H1N1(InfluenzaA(H1N1)pdm09),属于正粘病毒科RNA病毒,是能感染人、猪和其他脊椎动物的甲型流感病毒流行株,2009年在人群中引发呼吸性疾病大爆发,也曾引起过三次世界范围内的流感大流行,给经济发展和人类健康带来了严重影响。与季节性流感病毒相比,新型重配流感病毒株H1N1(pdm09)能在呼吸道复制,感染早期无明显症状,感染后可引发严重的细菌性和病毒性肺炎、呼吸衰竭、多器官损伤甚至死亡。由于流感病毒基因组为多节段单链RNA病毒,常发生重组变异和抗原漂移,严重制约了流感疫苗预防和药物治疗效果,目前虽然有针对流感病毒的疫苗和药物,但治疗效果不甚理想。因此,建立接近生理状态的流感病毒感染模型,对于抗流感病毒药物和疫苗的研发具有重要意义。流感病毒的研究多以细胞和动物作为研究模型,但是动物模型和人体之间存在种属差异,而常用的细胞模型,如A549肺癌细胞、16HBE细胞、FRhL细胞、MRC-5、WI-38细胞系、PER.C6细胞,多为癌细胞系或者病毒/癌基因永生化的细胞系,这些细胞的遗传背景和表型多已发生改变,从而使细胞失去其原有的正常生理功能。人呼吸道黏膜不仅是H1N1流感病毒感染机体的原发靶点,也是机体抵御流感病毒H1N1感染的位点,在机体的天然免疫和获得性免疫中发挥着重要作用。因此,构建人正常呼吸道上皮细胞模型,研究H1N1感染的免疫应答及病毒与宿主的早期相互作用,是最直观的、也是最接近病毒自然感染过程的体外研究模型。在本论文研究中,利用条件重编程(conditionalreprogramming,CR)技术在不导入外源基因的情况下,从正常气管和肺组织原代分离培养,建立了一株人正常气管上皮细胞(human normal tracheal epithelial cells,HNTEC)和一株正常的人肺上皮细胞(human normal pulmonary epithelial cells,HNPEC)。两株细胞能在体外连续增殖稳定传代。通过短串联重复序列STR基因分型分析,HNTEC细胞基因分型为 AMEL/X/X,D3S1358/15/17,D13S317/8/14,D7S820/9/12,D16S539/11/14,PentaE/11,D2S441/12/14,TPOX/8,TH01/6/9,D2S1338/21/24,CSF1P0/11/12,PentaD/8/11,D10S1248/13/15,D19S433/14/15.2,vWA/18/19,D21S11/30/31,D18S51/14,D6S1043/12/18,D8S1179/10/13,D5S818/11,D12S391/19/24,FGA/23。HNPEC 细胞基因分型为 AMEL/X/X,D3S1358/16,D13S317/8/9,D7S820/11,D16S539/11/12,Penta E/14/16,D2S441/10/12,TPOX/8/11,TH01/7/9,D2S1338/17/24,CSF1PO/12/13,PentaD/9/11,D10S1248/14/15,D19S433/13/14.2,vWA/14/16,D21S11/30,D18S51/15,D6S1043/11,D8S1179/10/15,D5S818/12,D12S391/15/25,FGA/22/25。基因分型结果经过全数据库比对,证实这两株细胞是未曾登记注册过的新细胞株。染色体核型分析证实这两株细胞无染色体结构和数目变异,均为人类正常二倍体核型。软琼脂克隆形成实验观察到,HNTEC、HNPEC细胞和16HBE细胞(癌基因永生化支气管上皮细胞)均发生细胞凋亡,而对照肺癌细胞A549在培养中出现大的细胞球形克隆,说明HNTEC和HNPEC细胞不同于肿瘤细胞,在体外无异常增殖能力和致瘤性。同时,HNTEC、HNPEC细胞在体外基质胶3D培养中呈边界清晰、表面光滑的球体生长,而对照肺癌细胞A549形成表面粗糙的不规则聚团生长。DNA损伤应答实验也表明这两株细胞p53-p21信号通路正常。此外,二维细胞水平免疫荧光标记表明,HNTEC、HNPEC细胞表达气管和肺特异性蛋白Cytokeratin5(CK5)、上皮细胞特异性蛋白Cytokeratin14(CK14)以及细胞干性标记分子p63,进一步说明这两株细胞是具有正常生理特性的呼吸道上皮细胞。接下来,我们利用建立的这两株正常呼吸道上皮细胞,观察了二维培养条件下对流感病毒感染的敏感性。将MOI为0.001的H1N1pdm09流感病毒接种于HNTEC、HNPEC细胞、16HBE和A549细胞,在病毒感染后的Oh、12h、24h、48h、72h观察细胞病变情况。H1N1pdm09流感病毒感染后,宿主细胞形态学发生改变,细胞变圆、脱落不贴壁。随着病毒感染时间的发展,致细胞病变效应越明显。更重要的是,观察到HNPEC细胞比HNTEC细胞更早出现细胞病变效应,说明H1N1特异性的细胞嗜性,肺来源的HNPEC细胞对H1N1病毒更加敏感。H1N1流感病毒在细胞中的增殖能力从大到小依次为HNPEC细胞、HNTEC细胞、A549细胞、16HBE细胞。同时用细胞免疫荧光方法标记H1N1pdm09病毒表面衣壳蛋白,观察到与形态学的细胞病变效应一致的变化,人正常肺上皮细胞HNPEC最先观察到绿色荧光的病毒蛋白,而且荧光颗粒数量最多,在感染病毒后24h即出现较强的荧光,在感染后72h荧光颗粒数量及强度都是最多的。人正常气管上皮细胞HNTEC在病毒感染后24h观察到病毒荧光蛋白,感染后72h病毒增殖明显,荧光蛋白强度和数量也较多。A549肺癌细胞也在病毒感染后48h观察到病毒荧光蛋白,而永生化细胞系16HBE对H1N1病毒不敏感。由此可见,H1N1病毒更加倾向于在肺细胞中复制增殖,随即由下呼吸道感染引发严重呼吸系统疾病。最后,我们利用气液界面3D培养方法,初步探索在体外重构了一个具有极性的气管上皮三维模型,用H&E染色法观察到该3D分化培养物与临床气管组织样本均具有相似的假复层上皮结构。综上所述,我们利用条件重编程技术成功构建了两株人正常呼吸道上皮细胞,并建立了 H1N1流感病毒感染上、下呼吸道上皮细胞的体外研究模型,结合初步建立的气管上皮3D模型,希望为流感病毒的研究、抗病毒药物和疫苗的研发提供一个更接近生理条件的体外感染模型。