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目的:本实验通过在C57BL/6小鼠背部注射黑色素瘤细胞使小鼠荷瘤。将来源于小鼠骨髓的原始细胞诱导培养成为成熟的负载黑色素瘤抗原的DC细胞后与小鼠脾脏来源的淋巴细胞共培养,得到对肿瘤有特异性杀伤作用的T淋巴细胞,然后通过磁珠分选纯化获得能分泌产生IFN-γ的效应细胞,将经过磁珠分选得到的效应细胞加入免疫检查点抑制剂(PD-1和CTLA-4通路抑制剂)共同孵育半小时后,将获得的效应细胞应用于已经荷瘤的小鼠体内。检测经过磁珠纯化加入免疫检查点抑制剂的效应T细胞对肿瘤微环境中的IL-10 m RNA、TGF-βm RNA表达的影响,流式检测小鼠脾脏内免疫抑制细胞(Tregs)的变化,相关组织病理切片观察小鼠输注效应细胞后有无发生免疫检查点抑制剂相关免疫副反应,观察各组荷瘤小鼠肿瘤体积大小变化情况、荷瘤小鼠生存期,探讨免疫效应细胞体外联合免疫检查点抑制剂(PD-1和CTLA-4通路抑制剂),能否在降低免疫检查点抑制剂“去刹车效应”而诱发的自身免疫反应同时进一步提高免疫抗肿瘤效应,以及本联合方案在清除肿瘤免疫抑制微环境方面的作用及意义,为建立新一代具有更高疗效的微环境干扰介导的细胞免疫治疗技术提供新的理论依据和实验数据。方法:1通过体外复苏培养小鼠的恶性黑色素瘤B16细胞,然后向已经脱毛的小鼠背部注射复苏的B16细胞,使小鼠荷瘤。2负载B16黑色素瘤全肿瘤抗原的小鼠骨髓来源DC细胞的培养:提取C57BL/6股骨胫骨骨髓细胞,向已经贴壁的骨髓细胞中加入鼠源rm IL-4、rm GM-CSF和黑色素瘤细胞裂解后得到的肿瘤抗原,最后通过加入肿瘤坏死因子TNF-α使DC细胞成熟。3通过磁珠阳性分选获得效应T淋巴细胞:将C57BL/6小鼠脾脏制备成细胞悬液,在得到的细胞悬液中加入淋巴细胞分离液分离后得到淋巴细胞,得到的淋巴细胞经过尼龙毛柱的过滤获得T淋巴细胞。T淋巴细胞培养2天后,按比例加入负载肿瘤抗原的成熟DC细胞后混合共培养3-4天,即可得到活化的效应性T淋巴细胞。将得到的活化的效应T淋巴细胞通过磁珠阳性分选方法筛选其中能分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞。4免疫检查点抑制剂与磁珠分选纯化的细胞共孵育:将磁珠分选获得的分泌IFN-γ阳性的效应T细胞加入PD-1和CTLA-4抑制剂,37°孵育半小时。5实验动物分组及治疗方法:将已经荷瘤的小鼠完全随机分为3个组,每个组40只。(A组)荷瘤对照组:向对照组的荷瘤小鼠鼠尾静脉注射0.2ml的生理盐水;(B组)磁珠分选联合免疫检查点抑制剂细胞治疗组:向荷瘤小鼠鼠尾静脉注射1×106个/0.2ml磁珠分选联合免疫检查点抑制剂的效应T淋巴细胞。(C组)免疫检查点抑制剂治疗组:每只荷瘤小鼠腹腔注射PD-1和CTLA-4抑制剂各20ug。观察不同治疗方法后各组荷瘤小鼠肿瘤体积大小的变化情况及生存期长短。6在细胞治疗后的第1、4、7、10、14天时,每个时间点处死小鼠以便提取各组荷瘤小鼠的肿瘤组织,实时定量RT-PCR法检测治疗后不同时间点的肿瘤组织中IL-10 m RNA、TGF-βm RNA表达的变化,比较通过不同治疗方法,荷瘤小鼠肿瘤微环境中不同细胞因子表达的变化情况。7在细胞治疗后的第7天取小鼠的脾脏制备成单细胞悬液,流式技术监测治疗后小鼠脾脏中Tregs细胞的含量,比较通过不同治疗方法,对荷瘤小鼠脾脏中免疫抑制细胞的影响情况。8分别在细胞治疗后的第1、4、7、14天,取小鼠肝、肺和小肠组织制备成病理切片,观察病理形态学变化,以及免疫检查点抑制剂与效应细胞体外共孵育后回输至小鼠体内后是否引起免疫检查点抑制剂的相关免疫副作用:反应性肝炎,肠炎和肺炎等。结果:1将处于对数生长期的5×106个B16恶性黑色素瘤细胞接种于6-8周的小鼠背部皮下,6-7天后小鼠背部接种部位出现明显的肉眼可见大小为0.5cm的皮下黑色瘤结节;2将小鼠骨髓来源DC细胞培养至第6天,镜下可见细胞由贴壁状态变为悬浮状态,而且细胞由规则圆形形态变为细胞表面有毛刺状突起的成熟的DC细胞形态,说明此时的DC细胞已经具备了抗原提呈的能力;3各组荷瘤小鼠肿瘤体积变化:单纯注射PBS的对照组荷瘤小鼠肿瘤生长迅速,给予单纯免疫检查点抑制剂及磁珠分选联合免疫检查点抑制剂的效应细胞治疗组,小鼠肿瘤生长缓慢,肿瘤生长速度明显慢于单纯荷瘤组小鼠,磁珠分选联合免疫检查点抑制剂效应细胞治疗组的荷瘤小鼠肿瘤生长速度略慢于单纯应用免疫检查点抑制剂治疗组的荷瘤小鼠肿瘤,俩个治疗组的小鼠肿瘤生长速度在第7天到第20天相比对照组呈显著降低的趋势;4各组小鼠生存期:A组(荷瘤对照组),B组(磁珠分选联合免疫检查点抑制剂组),C组(免疫检查点抑制剂组)各组之间进行生存期长短的比较,各组的生存期差异有统计学意义(P<0.05);5 RT-PCR法检测治疗后不同时间点的小鼠肿瘤组织中IL-10 m RNA、TGF-βm RNA表达的变化情况:在磁珠分选联合免疫检查点抑制剂治疗组中小鼠肿瘤组织中的IL-10 m RNA、TGF-βm RNA的表达明显低于荷瘤对照组(P<0.05),单纯应用免疫检查点抑制剂组也明显低于荷瘤组(P<0.05),但是磁珠分选联合免疫检查点抑制剂治疗组与单纯应用免疫检查点抑制剂组之间无明显差别。磁珠分选联合免疫检查点抑制剂治疗组中,肿瘤组织中IL-10 m RNA、TGF-βm RNA出现了随时间增加表达明显下降的趋势,三组肿瘤组织中IL-10 m RNA、TGF-βm RNA的表达除了磁珠分选联合免疫检查点抑制剂治疗组与单纯应用免疫检查点抑制剂组均存在显著性差异(P<0.05);6细胞流式结果:我们通过流式细胞术检测了经过治疗的荷瘤小鼠的脾脏免疫细胞的亚群比例变化。结果我们发现磁珠分选联合免疫检查点抑制剂效应细胞治疗和单纯应用免疫检查点治疗均有效减少了免疫抑制细胞(Tregs)的比例与绝对数,显著提高了CD8+T细胞。但是俩个组之间对免疫抑制细胞的抑制作用无明显差异;7病理切片结果:磁珠分选联合免疫检查点抑制剂组内没有出现反应性肝炎,肠炎和肺炎等免疫检查点的副反应;单纯应用免疫检查点抑制剂组中部分出现反应性肝炎,肠炎,肺炎和腹泻等。结论:1相比于荷瘤对照组,磁珠分选联合免疫检查点抑制剂细胞治疗组及单纯应用免疫检查点抑制剂组的小鼠肿瘤生长速度在7至25天明显下降。磁珠分选联合免疫检查点抑制剂组的肿瘤生长速度略慢于单纯应用免疫检查点抑制剂组,说明磁珠分选联合免疫检查点抑制剂的效应细胞能够明显的抑制小鼠肿瘤的生长进展。2磁珠分选联合免疫抑制剂治疗与单纯免疫检查点抑制剂治疗都能够有效延长荷瘤小鼠的生存期,磁珠分选联合免疫检查点抑制剂细胞治疗组的生存期略优于免疫检查点抑制剂组,但是单独应用免疫检查点抑制剂有几率导致免疫相关反应,引起生存期明显减少。3磁珠分选联合免疫检查点抑制剂治疗后,肿瘤组织中IL-10m RNA、TGF-βm RNA的表达明显下降,对IL-10 m RNA和TGF-βm RNA表达的影响与免疫检查点抑制剂组无统计学差别。4磁珠分选联合免疫检查点抑制剂治疗及单纯应用免疫检查点抑制剂均可以降低小鼠脾脏的免疫抑制细胞(Tregs)的数量,都可以有效的改变微环境的免疫抑制状态。5磁珠分选联合免疫检查点抑制剂组治疗后没有引起单纯应用免疫检查点抑制剂相关的肝炎,肠炎和肺炎等相关免疫副作用。