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研究背景蛛网膜下腔出血(SubarachnoidHemorrhage,SAH)是临床非常常见的卒中形式,由颅内动脉瘤破裂造成的蛛网膜下腔出血占85%左右,幸存者常常遗留神经功能障碍,给家庭和社会留下严重的精神和经济负担。既往在很长一段时间内,学者们都认为脑血管痉挛是导致SAH不良预后的主要决定因素,相应的研究热点也集中在血管痉挛的机制和药物研发上。但近年来的数项关于拮抗血管痉挛药物的多中心研究并未取得理想的效果。因此本领域的研究者们逐渐将目光转移到了如何减轻SAH出现后72小时内发生的早期脑损伤(Early Brain Injury,EBI)上。目前认为,SAH后EBI的病理生理学机制主要有血液对脑组织的直接刺激、颅内压的剧烈升高、脑灌注减少以及脑血流量下降等,这一系列的变化引起了各种复杂的分子机制及信号通路网络的激活,并最终导致了个体表现出的神经功能障碍。EBI的程度与临床患者及实验室动物模型的神经功能预后有着十分密切的联系,应用药物对EBI特别是神经炎症的发生过程进行干预,也是目前的研究热点所在,对于控制SAH发生后的EBI过程,以及进一步改善患者的预后,具有十分重要的意义。亚甲蓝(MethyleneBlue,MB)又称为亚甲基蓝、美蓝,是一种水溶性的芳香杂环化合物,一百多年来被用于高铁血红蛋白血症以及氰化物中毒的治疗。因其极易透过血脑屏障并能在神经系统内富集的性质,许多学者将其用于治疗实验性中枢神经系统病变及损伤,并发现其在神经退行性疾病、脑缺血性疾病以及颅脑损伤中均能够发挥神经保护作用,但是亚甲蓝在SAH后是否具有类似的神经保护作用,之前未见相关文献报道。最近有学者发现,亚甲蓝能够通过Akt/GSK-3β通路调控肌细胞增强因子2D(Myocyte Enhancer Factor 2D,MEF2D)介导的生存通路,在HT22小鼠海马神经元细胞系中对谷氨酸盐引起的细胞死亡起到保护作用。另外,MEF2D可能通过与小胶质细胞IL-10基因启动子区的一段特异性结合位点相结合,上调抗炎因子白介素10(Interleukin-10,IL-10)的表达,从而抑制下游炎症反应,减少神经元死亡。因此,我们将使用线栓穿刺法制作出SAH的大鼠模型,探索亚甲蓝在SAH后EBI中的神经保护作用,以及其通过Akt/GSK-3β/MEF2D通路对神经炎症的作用情况,为SAH的治疗提供新的思路及靶点。实验方法第一部分SD大鼠随机分为以下4组:假手术+溶剂组(即sham组),假手术+治疗组(即sham + MB组),蛛网膜下腔出血+溶剂组(即SAH +vehicle组),以及蛛网膜下腔出血+治疗组(SAH + MB组)。记录各组大鼠的死亡率、神经功能评分以及蛛血评分,干湿重法测定脑水含量、伊文思蓝检测血脑屏障破坏程度、实时定量PCR检测 TNF-α 水平,Western Blot 检测 TNF-α、IL-1β 及 IL-6 水平。第二部分SD大鼠随机分为以下7组:假手术组(即sham组),蛛网膜下腔出血后3小时组(SAH3h组),蛛网膜下腔出血后6小时组(SAH6h组),蛛网膜下腔出血后12小时组(SAH12h组),蛛网膜下腔出血后24小时组(SAH24h组)与蛛网膜下腔出血后72小时组(SAH 72 h组)。记录各组大鼠的死亡率,Western blot检测不同时间点MEF2D水平,并检测第一部分中各组标本胞核及胞质中MEF2D水平,实时定量PCR及Western Blot检测IL-10的表达水平,免疫荧光染色观察MEF2D以及IL-10的表达部位。第三部分SD大鼠随机分为以下4组:蛛网膜下腔出血+溶剂组(即SAH + vehicle组),蛛网膜下腔出血+治疗组(即SAH + MB组),蛛网膜下腔出血+抑制剂组(即SAH+ MK2206组),以及蛛网膜下腔出血+治疗+抑制剂组(SAH + MB + MK2206组)。记录各组大鼠的死亡率、神经功能评分以及蛛血评分。Western blot检测第一部分和本部分标本中Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β的水平,并检测本部分胞核及胞质中MEF2D水平,免疫荧光检测Akt与MEF2D共染情况,计数各组标本中IL-10、Iba-1、MPO阳性细胞数量并进行比较。实时定量PCR检测IL-10及TNF-α水平,Western Blot 检测 IL-10、TNF-α、IL-1β 及 IL-6 水平。结果第一部分SAH发生后24小时大鼠的神经功能评分显著降低,脑水含量增加,伊文思蓝渗出增加,各种炎症因子的表达量上升;而腹腔给予共计1.5mg/kg的亚甲蓝能够显著提高SAH大鼠的神经功能评分,降低脑水含量以及伊文思蓝的渗出情况,降低炎症因子TNF-α、IL-1β以及IL-6的表达。第二部分SAH发生后MEF2D蛋白水平显著下调并在24小时达到最低,72小时后基本回到原来的水平。MEF2D在神经元中高表达。SAH发生后核内MEF2D的表达量显著下降,而胞质中MEF2D的量出现上升。MB给药后核内MEF2D的表达量显著上升,胞质中MEF2D的量进一步上升。IL-10在神经元及小胶质细胞中均有表达,在SAH发生后24小时其表达量显著上升,MB给药能使IL-10表达量进一步上升。第三部分Akt与MEF2D存在共定位。SAH发生后24小时,Akt在丝氨酸473号位点及GSK-3β在丝氨酸9号位点的磷酸化水平均显著下降,MB给药能够显著提升Akt及GSK-3β在这些位点的磷酸化水平。在SAH +MB组中给予Akt的特异性抑制剂MK2206后,大鼠的神经功能评分显著下降,Akt及GSK-3β在相应位点的磷酸化水平、胞核及胞质中MEF2D的水平、炎症因子IL-10的表达水平均出现了显著下降。MB给药能够显著降低Iba-1和MPO阳性的小胶质细胞数量,而MK2206则逆转了 MB的这一效果。结论1.亚甲蓝能够通过改善脑水肿,抑制血脑屏障破坏,减轻SAH后的神经炎症反应,从而显著改善大鼠的神经功能损伤,在SAH发生后起到神经保护作用。2.亚甲蓝能够通过增加转录因子MEF2D在核内的分布,进一步促进IL-10的表达,从而减轻SAH后的神经炎症反应。3.亚甲蓝的神经保护作用可能与其对Akt/GSK-3β通路的激活有关,后者可能增加转录因子MEF2D在核内的分布进而促进IL-10的表达,从而减轻SAH后的神经炎症反应。