目的:血管增生（vascular hyperplasia）是动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）、高血压、血管成形术后再狭窄等心血管疾病中普遍存在的病理生理表现。其主要特征表现为血管损伤后,位于血管中膜呈收缩表型的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）出现表型转化,转变为合成表型,增殖并迁移至内膜从而导致的一种血管重构现象。血小板源生长因子（platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB）由血管损伤部位的血小板、内皮细胞、VSMC和炎性细胞分泌产生,与其受体（PDGF receptor-b,PDGFR-β）结合后能够引起VSMC表型转化,进而发挥促细胞增殖和迁移的作用,对于血管重塑和内膜增生的发生发展具有明显的促进作用。内皮和平滑肌细胞来源的neuropilin样分子（endothelial and smooth muscle cell-derived neuropilin-like molecule,ESDN）是一类I型跨膜蛋白（type-I transmembrane protein）,最初是在人类冠状动脉和高度转移性肺癌细胞中克隆得到的,其分子内含有一个CUB结构域和一个凝血因子V/VIII同源结构,与Neuropilins结构相似。课题组之前的研究表明,在培养的VSMC中,处于增殖状态时ESDN表达显著高于生长抑制的细胞,而ESDN的过度表达会抑制VSMC生长。在PDGF-BB诱导的VSMC增殖模型中,ESDN敲除及敲低能够上调PDGF-BB诱导的细胞增殖作用。该结果表明ESDN在调节血管细胞生长方面起着重要作用,其分子机制可能与ESDN对PDGF-BB及其受体的调控有关,但是,ESDN调控PDGF受体信号途径影响VSMC增殖和血管增生的机制研究目前尚不清楚。本实验利用小鼠颈总动脉结扎术诱导血管内膜增生模型以及PDGF-BB诱导VSMC增殖模型,探讨ESDN调控PDGF受体信号途径影响VSMC增殖及其与血管重构的关系。方法:1.平滑肌细胞特异性敲除小鼠的培育和基因型鉴定:利用从耶鲁大学医学院心血管系Dr.Mehran Sadeghi（Yale University School of Medicine）实验室引进Esdn^flox/flox小鼠和购买的SM22a-Cre小鼠培育平滑肌细胞特异性敲除小鼠。选取6⁸周龄大小的小鼠,按雌雄比例为2:1进行交配,繁殖仔鼠,取仔鼠鼠耳组织提取基因组DNA,用聚合酶链反应（PCR）技术进行基因型鉴定,成功培育出Cre^+/-Esdn^flox/flox小鼠及其对照Cre^-/-Esdn^flox/flox小鼠,同时提取血管组织Western blot验证其敲除效果。2.小鼠内膜增生模型制备与分组选取8¹2周的WT、Esdn^-/-小鼠,平滑肌细胞特异性敲除小鼠,雄性,各30只,随机分为3 d、7 d、14 d、21 d和假手术组,异氟烷吸入式麻醉,体式显微镜下行左侧颈总动脉结扎术,假手术组只分离血管,不结扎,分别于结扎术后3、7、14、21 d时生理盐水心脏灌流后取材。将取材的血管分为两部分,一部分用OCT包埋剂包埋、液氮迅速冷冻、冰冻切片,备用;另一部分用RIPA裂解液（50 mM Tris pH 7.5,150 mM NaCl,0.5%脱氧胆酸钠,1%NP-40,0.1%SDS,1 mM EDTA）,临用前加入complete proteinase inhibitor（Roche Applied Sciences）和phosphatase inhibitor cocktails（Sigma-Aldrich）裂解,提取总蛋白质,Western blot检测VSMC增殖标志蛋白骨桥蛋白（osteopontin,OPN）以及分化标志基因α-骨骼肌肌动蛋白（smooth musclea-actin,SMa-actin）、平滑肌22a（smooth muscle22 alpha,SM22a）的表达。3.冰冻切片HE染色和免疫荧光染色分析选取结扎不同时间血管组织的冰冻切片（5mm）,进行组织HE染色及免疫荧光染色,显微照相后利用Image J software（National Institutes of Health,USA）观察内膜增生和中膜变化确定其血管增生状态;利用荧光显微镜观察Esdn^-/-小鼠和野生型小鼠;平滑肌细胞特异性敲除小鼠Cre^+/-Esdn^flox/flox小鼠及其对照Cre^-/-Esdn^flox/flox小鼠各组不同时间点血管组织中ESDN、CD31（内皮细胞标志蛋白）和SMa-actin（VSMC标志蛋白）的阳性荧光强度。4.VSMC培养与siRNA敲低ESDN的表达按照本室报道的贴块法培养大鼠VSMC,取3-5代细胞进行实验。将VSMC接种在60mm小皿中,用含20%胎牛血清的无抗生素培养基,在37℃和5%CO₂细胞培养箱中孵育12-24小时后,待细胞生长至60-70%融合时,细胞用20 nM的ESDN siRNA或通用阴性对照（锐博）小干扰RNA转染,按照Lipofectamine RNAi Max试剂盒操作说明进行。转染24小时之后根据细胞密度换液,继续培养24 h后,换成无血清培养基血清饥饿24 h后,分别给予PDGF-BB（10 ng/mL）刺激不同时间（0、5、15、30 min）,收集RNA确定转染效率和蛋白用于Western blot检测PDGF信号途径的变化。5.细胞膜蛋白和胞浆蛋白的提取培养的VSMCs,利用siRNA敲低ESDN表达,血清饥饿24 h后,应用PDGF刺激不同时间后,利用Invent公司Minute-^TM总膜和质膜提取试剂盒分别提取胞浆和胞膜蛋白,Western blot检测PDGFR-β在敲低ESDN表达后在细胞各组分中分布的不同。6.细胞表面PDGFR-β的测定为观察ESDN表达对VSMC表面PDGFR-β动态变化的影响,培养的大鼠VSMC应用siRNA敲低ESDN的表达后,在PDGF刺激不同时间（0、5、30 min）的培养基中加入生物素（0.15 mg/mL sulfo-NHS-SS-biotin,Pierce,Rockford,IL）对细胞表面蛋白进行共价标记,10 min后应用1×PBS缓冲液（137 mM NaCl,2.7 mM KCl,2 mM KH₂PO₄,10 mM Na₂HPO₄）清洗并终止反应,加入细胞裂解液（50 mM Tris pH 7.5,150 mM NaCl,0.5%脱氧胆酸钠,1%NP-40,0.1%SDS,1mM EDTA）,临用前加入complete proteinase inhibitor（Roche Applied Sciences）和phosphatase inhibitor cocktails（Sigma-Aldrich）,离心收集上清用于细胞总PDGFR-β的测定;应用链合亲霉素（Streptavidin-agarose beads,Upstate Biotechnology,Lake Placid,NY）收集生物素标记的蛋白,清洗后上样Western blot检测细胞表面PDGFR-β的变化。结果:1.平滑肌细胞特异性Esdn敲除小鼠基因型鉴定对Esdn^-/-小鼠;平滑肌细胞特异性敲除小鼠Cre^+/-Esdn^flox/flox小鼠及其对照Cre^-/-Esdn^flox/flox小鼠进行基因型鉴定。Esdn^-/-小鼠基因型鉴定引物（PCR扩增产物长度为360 bp）:上游引物:5’-CAGCCAAACCTCCAGAAAAG-3’下游引物:5’-AAGCTTAAGTGATGTGACAG-3’Esdn^flox/flox小鼠基因型鉴定引物（280bp,野生型为230 bp）上游引物:5’-CAGCCAAACCTCCAGAAAAG-3’下游引物:5’-TCACAAGAGAGAGGGGTGCT-3’SM22 Cre小鼠基因型鉴定引物（阳性对照324 bp,Cre 100 bp）SM22-Cre上游引物:5’-GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC-3’SM22-Cre下游引物:5’-GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT-3’SM22-Cre阳性对照上游引物:5’-CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT-3’SM22-Cre阳性对照下游引物:5’-TAGGTGGAAATTCTAGCATCATC-3’琼脂糖凝胶电泳结果显示在目的区域呈现清晰的条带,表明基因型鉴定正确,平滑肌细胞特异性Esdn基因敲除小鼠构建成功。提取不同基因型小鼠血管组织进行Western blot检测ESDN的表达,在Esdn^-/-小鼠血管组织中未检测到ESDN的表达,而在平滑肌细胞特异性基因敲除小鼠血管组织中ESDN的表达较对照小鼠显著下降,结果进一步证实了基因型鉴定正确,表明平滑肌细胞特异性基因敲除小鼠构建成功。2.ESDN缺失促进内膜损伤后的血管增生WT、Esdn^-/-小鼠结扎不同时间后取材,HE染色结果显示,随着结扎时间的延长,与对照组相比,Esdn^-/-小鼠血管中膜VSMC排列紊乱,内膜逐渐增厚,管腔狭窄,在结扎21 d时达到高峰。随后Western Blot检测平滑肌增殖标志蛋白OPN,平滑肌分化标志蛋白SMa-actin、SM22a的表达情况,结果显示,与对照组相比,随着结扎时间的延长,Esdn^-/-小鼠血管组织中OPN的表达均逐渐增加,结扎21 d时达到高峰;SMa-actin、SM22a的表达均逐渐降低,结扎21 d时达到最低。应用免疫荧光染色技术进一步观察ESDN表达对血管中膜SMC增生的影响,结果显示,在结扎21 d时,ESDN的表达与血管组织中SMC标志物SMa-actin的表达呈现共定位现象,表明ESDN可能通过影响中膜SMC的增殖进而影响血管增生过程。这一结果在平滑肌细胞特异性敲除小鼠得到了进一步的验证。3.ESDN表达下调促进PDGF的信号途径为进一步探讨ESDN缺失促进血管增生的分子机制,体外培养大鼠VSMC,siRNA敲低ESDN的表达,血清饥饿后,用10 ng/mL的PDGF-BB处理VSMC不同时间后收集蛋白,Western blot检测PDGF受体磷酸化及其下游信号途径的变化。结果显示,与对照组相比,ESDN表达下调促进PDGF诱导的PDGFR-β的磷酸化活化,在PDGF刺激15 min达到峰值。同时对与VSMC迁移和增殖相关的PDGF下游信号分子进行了检测,Western blot结果显示,与对照组相比,ESDN表达下调促进PDGF诱导的MAPK-ERK和Akt的磷酸化活化,在PDGF刺激后的5 min和15 min各自达到其峰值。这一结果表明,ESDN表达下调可能通过促进PDGF诱导的PDGFR-β的磷酸化活化,进而激活下游相关信号分子MAPK-ERK和Akt的磷酸化,加速VSMC的迁移和增殖过程,与整体动物实验得到的结果一致。4.ESDN敲低加速PDGF诱导的PDGFR-β胞吞过程研究表明,PDGF与其相应的受体PDGFR-β结合后引起受体磷酸化活化并经过胞吞作用进入细胞质基质,为确定ESDN表达是否能够调控PDGF诱导的PDGFR-β胞吞过程,应用生物素标记细胞表面蛋白并用Streptavidin富集并Western blot检测细胞膜上PDGFR-β的分布,结果表明ESDN敲低后细胞表面的PDGFR-β较对照组显著减少,表明ESDN表达下调促进PDGF诱导的PDGFR-β胞吞过程;同时提取了膜蛋白、胞浆蛋白检测了PDGFR-β在细胞不同组分的分布,结果表明与对照组相比,ESDN敲低显著减少了PDGF刺激后PDGFR-β在细胞膜的分布,而在同一时间点PDGFR-β在细胞胞浆的分布显著高于对照组。这些结果表明,ESDN表达下调促进PDGF的信号途径可能是通过增强PDGFR-β胞吞过程相关。结论:1.ESDN缺失小鼠和平滑肌细胞ESDN特异性敲除小鼠血管中膜平滑肌细胞增殖和新生内膜增生增强;2.ESDN表达下调促进血管平滑肌细胞PDGF信号途径;3.ESDN调控PDGF的信号途径的分子机制与其对PDGFR-β胞吞过程的调控有关。