【摘 要】
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目的：EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一种常见的人类γ-疱疹病毒,与一系列的人类恶性肿瘤相关,包括鼻咽癌。EB病毒在其感染的肿瘤细胞中呈潜伏性感染,在细胞核外以环状游离
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目的：EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一种常见的人类γ-疱疹病毒,与一系列的人类恶性肿瘤相关,包括鼻咽癌。EB病毒在其感染的肿瘤细胞中呈潜伏性感染,在细胞核外以环状游离体(episome)的形式存在,并表达病毒潜伏基因。EB病毒编码的核抗原1(EBNA1)是唯一在所有感染细胞中持续表达的病毒蛋白。EBNA1在EB病毒的潜伏感染中起着重要作用,包括EB病毒基因组的复制和有丝分裂分离以及对其他病毒潜伏基因的转录激活。C666-1细胞系来源于未分化的鼻咽癌(NPC),是唯一持续携带EB病毒的鼻咽癌细胞系,表达了EB病毒编码的小RNA(EBERs)、EBNA1蛋白和潜伏膜相关蛋白(LMP)转录本。该细胞系携带了EBV-1基因组,具有羧基末端30bp碱基缺失的LMP1基因和V-val亚型的EBNA1基因。C666-1细胞系与中国华南地区常见的鼻咽癌异常相似,是鼻咽癌与EB病毒关系研究中重要而有力的工具。本课题目的在于利用RNA干扰技术抑制C666-1细胞中EBNA1的表达,研究EBNA1在鼻咽癌发病过程中的作用。
方法：设计了4条针对V-val型EBNA1编码区的siRNAs并转染C666-1细胞；采用Western blot证实了能有效抑制EBNA1表达的干扰序列；甲基噻唑基四唑(MTT)活力实验检测EBNA1干扰后C666-1细胞活力的变化,并利用2,7二氯荧光素二脂(DCFDA)探讨了细胞活力变化与活性氧(ROS)之间的关系；同时利用实时定量PCR芯片技术探索了和氧化应激与抗氧化相关基因的转录普变化,并通过RT-PCR和western blot进行了验证。
结果：Western blot证实了2条干扰序列EBNA1-1414和EBNA1-1437能有效抑制EBNA1表达；干扰EBNA1后C666-1细胞活力较对照组降低,同时细胞内活性氧产生增加；PCR芯片实验发现干扰EBNA1后花生四烯酸盐12-脂氧合酶(ALOXl2)基因蛋白表达有下调,谷胱甘肽还原酶(GSR)和过氧化物酶3(PRDX3)基因转录水平表达下调。
结论：本研究鉴定了在上皮细胞中一种新的EBNA1促癌机制。EBNA1可能是通过降低活性氧的产生促进细胞活力,并且由此促进了鼻咽癌的发生。EBNA1的干扰降低了C666-1细胞的活力提示鼻咽癌细胞中EBNA1的抑制可作为一种有价值的治疗手段。
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