背景高血压已成为严重的世界公众健康问题,靶器官损害是高血压最主要的死亡因素。其中,心肌纤维化(myocardial fibrosis, MF)的严重程度己成为决定高血压心脏靶器官损害发展及预后的主要因素。因此进一步明确高血压心肌纤维化的机制并寻找更有效的治疗和预防措施,具有深远的临床意义和理论价值。目前治疗高血压MF的药物主要包括：血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体抑制剂(ARB)、醛固酮受体抑制剂、p受体阻滞剂、他汀类及天然药物。随着人们越来越关注化学药品的副作用及局限性,如ACEI及ARB类药物的钾潴留使肾功能不全病人应用需谨慎等,则对天然药物的信赖与日俱增。天然药物是指经现代医药体系证明具有一定药理活性的动物药、植物药和矿物药,具有获得方便、廉价、副作用小等特点。近几年天然药物的研发迅速进展,禁制趋于宽松。葡萄籽原花青素(grape seeds procyanidine extracts, GSPE)是葡萄籽所含的最主要的有效成分,具有抗氧化、清除自由基的作用。近年国内外的研究还提出GSPE具有抗动脉粥样硬化、抗氧化应激、抗炎、抗肿瘤、抗衰老等作用。我们课题组前期的研究也发现GSPE可以延缓动脉粥样硬化、抗心律失常,对db/db小鼠主动脉、心脏、肾脏、视网膜等组织均有保护作用,对糖尿病大鼠周围神经也有保护作用,还可以调节糖尿病大鼠肾组织谷胱甘肽-S-转移酶M(GSTM)的表达。然而,GSPE在高血压心肌纤维化中的作用及机制研究未见报道。心肌纤维化的主要病理改变是心肌间质内心肌成纤维细胞(cardiac fibroblast cells,CFs)增殖、分化、迁移,致胶原蛋白异常沉积增多、降解减少。既往主要从血流动力学、氧化应激、炎症及转化生长因子β-1/smads家族蛋白3(TGFβ-1/smad3)等信号通路方面研究延缓MF进展的作用及机制。最近的研究发现细胞骨架蛋白调节蛋白与MF也密切相关。丝切蛋白-1(cofilin-1)是细胞骨架蛋白即F-肌动蛋白(F-action)的调节蛋白,其活性主要通过磷酸化/去磷酸化来调节。在cofilin-1中,LIM激酶(LIM kinase,LIMK)可通过结合Ser-3氨基末端的LIMK1和LIMK2的磷酸化位点对cofilin-1进行专一性磷酸化。目前发现Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-activated kinase,ROCK)等Rho(Ras homologue)家族成员均可在上游通过链式反应激活LIMK,进而激发cofilin-1的去磷酸活性。既往研究还发现RhoA/ROCK通路与一些器官的慢性纤维化有关。我们课题组前期也运用定量标记比较蛋白质组学(iTRAQ)技术分析发现,cofilin-1在高血压心肌纤维化组织中具有重要的差异性表达,提示在MF中发挥重要的作用。但是,对于cofilin-1/ROCKl在高血压心肌纤维化中的作用及GSPE是否也通过影响cofilin-1发挥抗心肌纤维化的分子机制国内外尚未见报道。因此本研究的假说如下：高血压心肌纤维化中cofilin-1表达增高；GSPE具有抗高血压心肌纤维化的作用,其分子机制为下调cofilin-1的表达。本部分研究选用自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats,SHRs)进行体内实验,应用心脏超声、心肌组织的各种染色法及电子透视电镜观察心脏宏观结构、心脏功能、心肌纤维化病理改变及心肌超微结构,来明确GSPE对高血压心肌纤维化的作用；应用组织免疫荧光染色法明确cofilin-1在心肌组织中的表达及定位；应用酶联免疫吸附实验(ELISA)、蛋白质印迹法(western blot)、实时定量逆转录-聚合酶链式反应(real time quantitative RT-PCR)法从分子水平明确GSPE抗心肌纤维化的作用及分子调控机制。目的1.研究GSPE对SHR抗心肌纤维化的作用。2.研究cofilin-1介导的GSPE抗SHR心肌纤维化的分子调控机制。方法1. 实验动物及分组20周龄雄性SHR大鼠24只,分为(1)高剂量GSPE组(SHRH):250mg/kg/d,灌胃,n=8； (2)低剂量GSPE组(SHRL):灌胃,n=8；(3)对照组(SHRC):生理盐水,灌胃,n=8。此外,选择8只WKY鼠做空白对照(WKYC),对比观察高血压的进展。试养一周进入实验,治疗22周末处死动物。2. 一般指标的测定(1)血压及心率检测：每两周末及处死前通过BP2006A智能鼠尾无创血压计检测各组大鼠尾动脉收缩压、舒张压、平均动脉压及心率。(2)血液生化指标及心衰指标的测定：实验前大鼠颈静脉取血,大鼠处死后心脏取血,检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-C (LDL-C)、N末端脑钠肽前体(NT-ProBNP)。3. 心脏宏观结构和功能的测定：(1)实验开始前及GSPE治疗22周末采用二维、M超和组织多普勒超声心动图技术检测大鼠的左心室结构、收缩和舒张功能变化。(2)大鼠处死前称量大鼠体重(body weight, BW)及处死后称量心脏重量(heart weight, HW),并计算心脏重量指数HW/BW(mg/g)。4.心肌病理组织学的测定(1)心肌组织纤维化程度的测定：HE染色观察心肌组织病理形态变化,masson染色观察胶原纤维面积,天狼星红染色观察各型胶原纤维的分布；免疫组化法测定大鼠心肌组织中α-SMA、collagen I的蛋白表达情况；(2)心肌超微结构观察：透射电镜观察心肌组织细胞内肌丝、肌节、内质网及高尔基复合体等超微结构；5.心肌组织中基因、蛋白表达检测：western blot及RT-PCR法测定大鼠心肌组织中α-SMA、collagen I、MMP-9、TIMP-1表达情况；组织免疫荧光染色、western blot及RT-PCR法测定大鼠心肌组织中cofilin-1的表达情况；western blot及RT-PCR法测定大鼠心肌组织中ROCK1的表达情况；western blot及RT-PCR法测定大鼠心肌组织中TGFβ-1、Smad3、-smad3的表达情况。6.心肌组织氧化应激指标检测：EILISA法测定大鼠心肌组织的U2O2、NO、 MDA、SOD的蛋白表达；western blot法测定大鼠心肌组织中Nrf2的表达情况。结果1. GSPE对SHR一般情况的影响实验前,与WKYC组比较,SHR组在体重方面无差异(P>0.05),在心率、收缩压、舒张压和平均动脉压方面均显著升高(P<0.01),而SHR组间无统计学差异(P>0.05)；GSPE治疗22周末,与WKYC组比较,SHR各组在体重方面比较仍无统计学差异(P>0.05),但是,在心率、收缩压、舒张压和平均动脉压方面比较仍均显著升高(P<0.01)；与SHR对照组比较,SHR治疗组在心率、收缩压、舒张压和平均动脉压方面较低(P<0.05),但GSPE治疗的高低剂量组间无显著差异(P>0.05)。GSPE治疗前后,实验鼠各组在血脂及心衰指标方面差异无统计学意义(P>0.05)。2. GSPE对SHR心脏宏观结构及功能的影响(1)心脏超声指标：与实验前比较,GSPE治疗22周末,WKYC组舒张功能指标E’/A’显著下降(P<0.01),IVSd显著增厚(P<0.01),LVPWd显著增厚(P<0.01)。与实验前比较,GSPE治疗22周末,SHR各组舒张功能指标E’/A’显著下降(P<0.01),LVEF升高(P<0.01或P<0.05),LVIDd缩小(P<0.01或P<0.05),IVSd显著增厚(P<0.01),LVPWd显著增厚(P<0.01)。实验前,与WKYC组比较：SHR各组E’/A’显著下降(P<0.01),IVSd显著增厚(P<0.01)。GSPE治疗22周末,与WKYC组比较：SHR各组的E’/A’显著下降(P<0.01)；SHRC组LVEF升高(P<0.05)；SHR各组IVSd增厚(P<0.01或P<0.05),LVPWd显著增厚(P<0.01)。GSPE治疗22周末,与SHRC比较：GSPE治疗组SHR的E’/A’显著增加(P<0.01),LVEF显著下降(P<0.01),LVIDd增大(P<0.01或P<0.05),IVSd变薄(P<0.05),LVPWd变薄(P<0.01)。GSPE治疗22周末,SHRH组与SHRL组比较：E’/A’增加(P<0.05),LVEF下降(P<0.05),IVSd变薄更显著(P<0.05),LVPWd变薄更显著(P<0.01)。(2)心脏大体标本显示：与WKYC组比较,SHR各组心脏增大。定量分析心脏重量/体重比值(HW/BWmg/g)结果显示：与WKYC组比较,SHR各组均有增高(P<0.05或P<0.01)；与SHRC比较,SHR治疗组有降低趋势,但无显著统计学差异(P>0.05)。3. GSPE抗SHR心肌纤维化的组织病理学结果(1)心肌HE染色：WKYC大鼠心肌细胞形态、横纹、闰盘及细胞核正常；肌纤维无断裂。纵切面观察：SHR各组细胞内可见颗粒状物质,细胞肿大变形。大部分细胞无明显间隙,细胞核肥大或固缩。心肌纤维断裂并融合呈波浪状,有些横纹、闰盘尚清晰。SHR治疗组较SHRC,心肌细胞肿胀减轻,心肌纤维断裂减少,大部分横纹、闰盘清晰。横截面观察：单个细胞面积增加,直径增宽；SHR治疗组较SHR对照组,心肌细胞直径增宽减轻,单个心肌细胞面积缩小。(2)心肌masson染色：纵切面观察：与WKYC组比较,SHR各组大鼠的心肌间质、心内膜下胶原纤维显著增多,且排列走行紊乱。横截面观察：可见血管管腔周围胶原纤维显著增多。与SHRC组大鼠相比,SHR治疗组大鼠心肌间质、心内膜下及血管管腔周围胶原纤维显著减少,SHRH组较SHRL组改善更显著。胶原纤维面积(CVF)相对比值及管周胶原面积/管腔面积(PVCA/LA)的相对比值结果显示：与WKYC组大鼠相比,SHR各组大鼠的胶原纤维表达量显著增多(CVF,P<0.01; PVCA/LA,P<0.01); SHR治疗组与SHR对照组比较CVF及PVCA/LA均显著减少(P<0.01),且SHRH组较SHRL组减少更显著(P<0.05)。(3)心肌天狼星红染色：WKYC组胶原纤维分布少,且血管周围少有分布。SHR各组均显示胶原纤维显著增多,排列紊乱、断裂,血管周围更多见,以Ⅰ型胶原纤维为主；SHR治疗组较对照组胶原纤维分布减少,排列紊乱减轻,断裂较少,血管周围分布显著减少,且上述情况高剂量组较低剂量组改善均显著。(4)心肌超微结构观察：WKYC组大鼠中,肌原纤维排列规整、稀少；肌小节结构正常,Z线和明暗带清晰；闰盘结构正常。SHR各组大鼠中,胶原纤维排列紊乱、丰富；肌小节结构破坏；肌丝溶解；Z线断裂成波浪状；线粒体增生、排列紊乱,形态肿大变形,出现电子透亮区,看不到嵴,且取代肌丝溶解的区域；粗面内质网和高尔基体发达,提示分泌功能增强；细胞核肿大变形,核膜呈缺口状,染色质成团状。SHR治疗组大鼠较对照组大鼠Z线断裂改变程度减轻,肌丝溶解消失,被增生的线粒体取代的区域减少；粗面内质网和高尔基体稍欠发达,提示合成分泌功能稍减低。(5)心肌免疫组化：α-SMA及collagen I蛋白主要在心肌间质和胞浆中表达。WKYC组中少量表达,呈条索状、平行/波浪状与肌纤维长轴平行排列,小血管周围呈不连续分布。SHR各组表达显著增多,排列紊乱,血管周围分布为主。SHR治疗组较SHR对照组表达减少。半定量统计分析显示：与WKYC组大鼠相比,SHR各组α-SMA、 collagen I表达显著增高(P<0.01或P<0.05)；SHR治疗组与SHR对照组比较表达显著减少(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.05)。4. GSPE抗SHR心肌纤维化的分子机制4.1 GSPE对SHR心肌纤维化组织中α-SMA、collagen I、MMP-9、TIMP-1基因及蛋白表达的影响RT-PCR结果：与WKYC组相比,SHR各组中TIMP-1mRNA表达显著增多(P<0.01),但SHR治疗组较SHR对照组表达减少(P<0.01或P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.05)。与WKYC组相比,SHR各组中MMP-9mRNA表达显著减少(P<0.01或P<0.05),但SHR治疗组较SHR对照组表达减少(P<0.01),且呈剂量依赖性(P<0.01)。Western blot结果：与WKYC组相比,SHR各组中α-SMA、collagen I、 TIMP-1表达显著增多(P<0.01/P<0.05),但SHR治疗组较SHR对照组表达显著减少(P<0.01或P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.01或P<0.05)。与WKYC组相比,SHR各组中MMP-9表达显著减少(P<0.01或P<0.05),SHR治疗组较SHR对照组表达增多(P<0.01或P<0.05),且均呈剂量依赖性(P<0.01或P<0.05)。4.2 GSPE抑制SHR心肌纤维化组织中cofilin-1基因及蛋白的表达Cofilin-1的表达及定位：免疫荧光染色显示,各组心肌组织中cofilin-1蛋白主要在心肌间质中表达。RT-PCR结果：SHR各组与WKYC组相比,cofilin-1 mRNA表达显著增多(P<0.05)；SHR治疗组较SHR对照组cofilin-1 mRNA的表达减少(P<0.05),SHRH组较SHRL组cofilin-1 mRNA表达有减少的趋势,但无统计学差异(P>0.05)。Western blot结果：SHR各组与WKYC组相比,cofilin-1表达显著增多(P<0.01)；SHR治疗组较SHR对照组cofilin-1表达显著减少(P<0.01或P<0.05),SHRH组较SHRL组cofilin-1表达有减少的趋势,但无统计学差异(P>0.05)。4.3 GSPE抑制SHR心肌纤维化组织中ROCK1基因及蛋白的表达RT-PCR结果：SHR组与WKYC组相比ROCKlmRNA表达显著增多(P<0.01)；SHR治疗组较SHR对照组ROCKlmRNA的表达减少(P<0.05),SHRH组较SHRL组ROCKlmRNA表达有减少的趋势,但无统计学差异(P>0.05)。Western blot结果：SHR组与WKYC组相比,ROCK1表达显著增多(P<0.01)；SHR治疗组较SHR对照组ROCK1表达显著减少(P<0.01或P<0.05),SHRH组较SHRL组ROCK1表达有减少的趋势,但无统计学差异(P>0.05)。4.4 GSPE抑制SHR心肌纤维化组织中TGFβ-1/smad3信号通路基因和蛋白的表达RT-PCR结果：SHR各组与WKYC组相比TGFβ-1mRNA表达显著增多(P<0.01),但SHR治疗组较SHR对照组TGFβ-1mRNA的表达减少(P<0.01),且呈剂量依赖性(P<0.05)Western blot结果：SHR各组与WKYC组相比,TGFβ-1、smad3及P-smad3表达均显著增多(P<0.01)；SHR治疗组较SHR对照组,TGF β-1、p-smad3表达显著减少(P<0.01或P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.01)。5. GSPE对SHR心肌氧化应激的影响ELISA法测定氧化应激指标：SHR各组较WKYC组H2O2及NO含量均显著增多(P<0.05或P<0.01),SHR组间均无显著差异(P>0.05)；SHR各组较WKYC组MDA及SOD均显著减少(P<0.01),MDA在SHR组间无显著差异(P>0.05),但SOD在SHR治疗组较SHR对照组显著增多(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.05)。Western blot法测定Nrf2蛋白表达：SHR各组与WKYC组相比,Nrf2蛋白表达显著下降(P<0.01),但SHR治疗组较SHR对照组Nrf2蛋白表达显著升高(P<0.01或P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.01)。结论1. GSPE能够显著抑制SHR的心肌纤维化,对心肌结构及功能损伤起到保护作用。2. GSPE通过抑制cofilin-1、ROCK1蛋白表达发挥抗高血压心肌纤维化的作用。3.SHR心肌中cofilin-1表达显著增加,且主要分布于心肌间质内,在MF中具有重要的调节作用。背景心肌纤维化是多种心脏疾病,如高血压心脏病、心肌梗死、心肌病、糖尿病心肌病等发展到一定阶段的共同病理改变。心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)是存在于心肌间质内,通过增殖、分化和迁移增加分泌等功能,从而导致MF的主要效应细胞。近几年的研究发现骨架蛋白调节蛋白与MF及细胞增殖、分化、迁移等密切相关。因此明确CFs分化的机制,并寻找有效的治疗和预防措施,对于进一步阐明心肌纤维化的机制及寻找有效的治疗药物具有深远的意义。Cofilin-1是存在于真核生物中的一种低分子量(21 kD)的肌动蛋白(actin)结合蛋白,其基本功能是增强肌动蛋白丝的转换。Cofilin-1可以通过切割活性推进actin转变为束状结构,可以增加F-actin的拆卸率,改变G-actin的循环速度,从而重塑actin构架,影响细胞的生理运动、病理改变。既往的研究发现,在体外细胞水平,cofilin-1主要影响细胞的迁移和增值；在体内,cofilin-1的研究主要在肿瘤领域,如在乳腺肿瘤细胞的侵袭性亚群中检测到mRNA水平的cofilin-1的自发性过度表达,在口腔鳞状细胞癌、肾细胞癌、卵巢癌中的cofilin-1高度表达。近年的研究发现cofilin-1失活可导致蛋白尿；在高血压肾脏中通过参与调节抗炎增加肾脏的损害；在大动脉中通过参与调解抗氧化应激增加动脉结构及功能的损害；在心血管领域,有文献证实cofilin-1在主动脉夹层组织中的表达量较正常组织显著减少,与平滑肌细胞、内皮细胞的排列、增殖、迁移密切相关,并参与了Rho/ROCK相关的信号通路。Pho M等还报道cofilin-1是心脏瓣膜疾病中肌成纤维细胞分化的重要标志。在本研究的第一部分发现：高血压大鼠心肌组织间质中cofilin-1表达增加；代表CFs细胞分化的α-SMA的表达也显著增加；同时发现GSPE可以同时下调cofilin-1及α-SMA在心肌纤维化组织中的表达。上述结果提示,GSPE可能通过调节CFs中cofilin-1的表达,减少CFs向肌成纤维细胞(myocardial fibroblasts, MFs)的分化及胶原蛋白的合成,从而起到抗心肌纤维化的作用。转化生长因子β-1是最重要的促纤维化生长因子,为诸多因素所致MF的共同通路。既往研究发现：体内基因转染TGFβ-1可诱导MF；体外具有抑制细胞生长、促进细胞分化、调节细胞外基质生成及降解等多种作用；且与多种信号通路,如Rho/ROCK等串联交话。胶原蛋白(collagen)为人体主要的细胞外间质成分,主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V型,collagen I的合成增多、降解减少及异位沉积是MF的病理基础。而内源性家族蛋白酶,即基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)及金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of matalloproteinase,TIMPs)则分别促进及抑制collagen的降解,其中MMP-9及TIMP-1及3研究最为广泛。因此,MMP-9及TIMP-1被广泛用于检测胶原蛋白的降解。另外,CFs分化为MFs后,具有更强的合成及分泌胶原蛋白的能力,且α-SMA的表达明显增加,所以α-SMA已被大量研究作为检测CFs分化的标志。本研究的第一部分也发现,高血压心肌纤维化组织中cofilin-1、 TGFβ-1、α-SMA、collagen Ⅰ、TIMP-1的表达均显著性升高,MMP-9显著性降低；同时发现GSPE干预治疗后cofilin-1、TGFβ-1、α-SMA、collagen Ⅰ、 TIMP-1的表达均显著性下降,MMP-9显著性升高。因此,为进一步探讨cofilin-1介导的GSPE抗心肌纤维化的分子调控机制,本部分体外实验,我们采用了TGFβ-1刺激CFs分化,并给予cofilin-1干扰慢病毒和GSPE干预,应用western blot法检测细胞的分化及胶原蛋白的合成、降解,从而进一步阐明cofilin-1在心肌纤维化中的分子调控机制及GSPE的干预靶点。目的1. 研究cofilin-1在CFs分化及胶原蛋白合成中的分子调控机制。2. 研究cofilin-1介导的GSPE抑制CFs分化和胶原蛋白合成的分子机制。方法1. CFs的培养及分化：(1)在时间梯度实验中,人类CFs (human CFs,HCFs)应用10 ng/ml的TGFβ-1分别刺激0、24、48和72小时；在浓度梯度实验中,我们应用0、5、10和50ng/ml的TGFβ-1刺激HCFs48小时。收集细胞,提取蛋白,检测a-SMA和cofilin-1的表达情况。(2)根据转染病毒的不同,将细胞分为4组：1)PBS空白对照组：只加PBS,不加其他干预；2) TGFβ-1刺激对照组：仅给予TGFβ-1刺激；3) TGFβ-1刺激+LV-CON-RNAi:转染携带乱序siRNA慢病毒；4) TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi:转染携带CFL-RNAi (28562-1)的慢病毒。1)组给予PBS,2)、3)和4)组给予10ng/ml的TGFβ-1刺激,培养48h,收集细胞。(3)根据GSPE干预不同,将细胞分为4组：1) TGFβ-1刺激对照组；2) TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi;3) GSPE+TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi;4) GSPE+TGFβ-1刺激组；1)和2)组单纯应用培养基培养,3)和4)组培养基内加入GSPE,调整GSPE浓度为50ug/ml进行培养。各组均给予lOng/ml的TGFβ-1刺激48h,收集细胞。2. 倒置荧光显微镜：检测携带报告基因GFP的慢病毒转染效果。3. Western blot:收集细胞,提取蛋白,检测CFs内α-SMA、cofilin-1、 collagenⅠ、MMP-9和TIMP-1蛋白的表达水平。结果1. CFs分化对cofilin-1蛋白表达的影响Cofilin-1蛋白的表达呈CFs分化程度依赖性增加,即随α-SMA蛋白的表达增强而增强,当α-SMA蛋白的表达最强时,cofilin-1蛋白的表达也最强。α-SMA和cofilin-1蛋白表达呈TGFβ-1刺激时间依赖性增加(P<0.01)：24小时开始α-SMA和cofilin-1蛋白表达开始显著增高(P<0.01),48小时达最高(P<0.01),48小时和72小时之间无显著差异(P>0.05)。α-SMA和cofilin-1蛋白的表达呈TGFβ-1刺激浓度依赖性增加(P<0.01 ); 5ng/mlTGFβ-1刺激组α-SMA和cofilin-1蛋白表达开始显著增高(P<0.01) , 10ng/mlTGF β-1刺激组表达最高,50ng/ml和lOng/ml TGF β-1刺激组间上述蛋白表达无统计学差异(P>0.05)。2. HCFs中慢病毒干扰cofilin-1的效率和效果将CON-RNAi、CFLl-RNAi(28560-1)、 CFLl-RNAi(28561-1)及CFL1-RNAi(28562-1)分别转染HCFs,转染72小时后观察慢病毒携带的报告基因GFP的表达情况,发现感染效率均大于70%,进而收集细胞、提取蛋白进行检测。结果表明,CFLl-RNAi(28560-1)、 CFLl-RNAi(28561-1)及CFL1-RNAi(28562-1)转染致cofilin-1蛋白表达分别减少52%、88%和92%,进而筛选出最有效的干扰位点CFLl-RNAi(28562-1)用于随后细胞实验中LV-CFL1-RNAi相关组的转染。3. Cofilin-1对CFs分化、胶原蛋白合成的促进作用及对胶原蛋白降解的抑制作用与PBS的空白对照组比较,TGF0-1刺激的各组细胞α -SMAn collagen I及TIMP-1蛋白的表达均显著性升高(P<0.01),MMP-9蛋白的表达均显著性降低(P<0.01)；与TGFP-1刺激的对照组比较,TGFe-1刺激+LV-CFL1-RNAi组α-SMA、 collagen I及TIMP-1蛋白的表达均显著性降低(P<0.01),MMP-9蛋白的表达显著性升高(P<0.01)；TGF3-1刺激+LV-CON-RNAi组上述蛋白的表达均无显著变化(P>0.05)。4. GSPE对CFs中cofilin-1蛋白表达的抑制作用与TGFP-1刺激的对照组比较,GSPE+TGFP-1组cofilin-1蛋白的表达显著性降低(P<0.01),TGFP-1刺激+LV-CFLl-RNAi组cofilin-1蛋白的表达显著性降低(P<0.01),GSPE+TGF P -1刺激+LV-CFLl-RNAi组cofilin-1蛋白的表达显著性降低(P<0.01)；与GSPE+TGF P -1组比较,TGF P -1刺激+LV-CFLl-RNAi组cofilin-1蛋白的表达显著性降低(P<0.01)；GSPE+TGF-1刺激+LV-CFL1-RNAi组cofilin-1蛋白的表达显著性降低(P<0.01)；与TGF β-1刺激+LV-CFL1-RNAi组比较,GSPE+TGF β-1刺激+LV-CFL1-RNAi组上述蛋白表达均无显著差异(P>0.05)。5. GSPE对CFs分化、胶原蛋白合成的抑制作用及对胶原蛋白降解的增强作用与TGF β-1刺激对照组比较,GSPE+TGF β-1组α-SMA、collagen I及TIMP-1蛋白的表达均显著降低(P<0.01),MMP-9蛋白的表达均显著增加(P<0.01);与TGFβ-1刺激对照组比较,TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi组α-SMA、 collagen I及TIMP-1蛋白的表达均显著性降低(P<0.01),MMP-9蛋白的表达均显著性升高(P<0.01)；GSPE+TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi组α-SMA、 collagen I及TIMP-1蛋白的表达均显著性降低(P0.01),MMP-9蛋白的表达均显著性增加(P<0.01)；与GSPE+TGF β-1组比较,TGF β-1刺激-HLV-CFL1-RNAi组α-SMA、 collagen I及TIMP-1蛋白的表达均显著性降低(P<0.01),MMP-9蛋白的表达均显著性升高(P<0.01)；GSPE+TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi组α-SMA、 collagen I及TIMP-1蛋白的表达均显著性降低(P0.01),MMP-9蛋白的表达均显著性增加(P<0.01)；与TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi组比较,GSPE+TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi组上述蛋白表达均无显著差异(P>0.05)。结论1. Cofilin-1促进CFs分化,增加胶原蛋白合成、减少胶原蛋白降解。2. GSPE通过抑制CFs中cofilin-1的表达,减少CFs分化,进而减少胶原蛋白合成、增加其降解,从而起到抗心肌纤维化的作用,cofilin-1可能是GSPE的干预靶点。