精子介导基因转移(Sperm-mediated gene transfer, SMGT)是目前最简单的转基因动物生产技术，但该方法重复性差、实验结果不稳定。本研究对SMGT的几个关键环节进行了研究，以期建立稳定、高效的技术体系，同时利用该技术体系制备hHT/hDAF双基因转移小鼠模型，为进一步开展异种器官移植奠定基础。　　 第一部分、基于树枝状聚合物建立小鼠精子介导基因转移技术的研究　　 目的：研究外源DNA与精子相互作用后的定位及内化率是精子载体法制备转基因动物的关键环节，为建立小鼠精子介导基因转移技术奠定基础。　　 方法：以标记的DNA片段为示踪材料，就精子与树枝状聚合物(Dendrimers)共孵育后同外源DNA相互作用的基本特征及影响因素进行研究。　　 结果：小鼠精子同树枝状聚合物共孵育后可自发性结合外源DNA，外源DNA最初结合于顶体后区质膜外表面，随后部分内化进入细胞内。精子对外源DNA的结合和内化能力随供体的不同而差异明显，在35只小鼠中，结合率（DNaseⅠ消化前）波动于4.6％～62.4％，内化率（DNaseⅠ消化后）波动于2.1％～53.8％，个体间差异显著(P＜0.01)。对于同一供体的精子而言，阻止DNA结合的最主要因素是精浆，与射出的原精液相比，洗涤后精子的结合率和内化率分别提高了3倍和5倍;其次精子获能也将导致结合率和内化率降低(P＜0.01)。死精子不能完成外源DNA的内化过程，但反复冻融导致质膜破裂的死精子具有更高的结合率，而且阳性率与动物个体无关。上述结果提示，筛选合适的精子供体，采用优化的转染处理方法是提高精子载体方法效率的前提和保证。　　 第二部分、EGTA等影响SMGT效率的研究　　 目的：研究EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对精子活力和体外存活时间、精子顶体反应发生率、精子结合外源DNA能力以及内化DNA降解的影响，提高SMGT效率。　　 方法：以DIG标记DNA，以免疫组织化学法研究EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对SMGT效率的影响。　　 结果：核酶抑制剂ATA提高精子活力和体外存活时间，增强精子结合外源DNA能力，但ATA添加组精子结合的外源DNA在细胞内几乎全部被降解;EGTA和蛋白酶抑制剂PMSF对内化进入精细胞的外源DNA有良好的保护作用，然而二者阻止精子发生顶体反应;此外，PMSF提高精子对外源DNA结合能力，增强精子运动活性，而EGTA与此正好相反;同时在培养液中添加EGTA和ATA，精子活力、顶体反应发生率和外源DNA结合能力都较EGTA单独加入组有所改善，而且内化DNA的降解效应也被明显抑制。对于精子介导基因转移过程中，在培养液中同时加入EGTA和ATA，既有利于外源DNA结合以及内化DNA的完整性，又保证了精子的受精能力。　　 第三部分、hHT/GFP融合基因表达载体的构建及在小鼠成纤维细胞中的表达　　 目的：构建α-1，2岩藻糖苷转移酶（hHT）基因与绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)基因融合表达载体pEGFP-C1-hHT，并在小鼠成纤维细胞表达，验证其有效性。　　 方法：提取人总RNA，反转录后以cDNA为模板PCR扩增hHT基因，连接至pMD18-T载体后进行hindⅢ、kpnⅠ双酶切，回收酶切片段后插入pEGFP-C1，构建融合表达载体后转染小成纤维细胞。　　 结果：成功克隆了hHT基因并构建了融合表达载体pEGFP-C1-hHT。采用脂质体法转染小鼠成纤维细胞48h后观察到GFP阳性细胞。对GFP阳性小鼠成纤维细胞进行PCR及Western blot，检测hH基因的整合及表达情况。PCR结果表明hHT基因整合入小鼠基因组。Western blot检测到了hHT基因的表达。上述结果表明，成功构建了融合表达载体pEGFP-C1-hHT，并可应用于进一步转基因研究。　　 第四部分、hDAF/RFP融合基因表达载体的构建及在小鼠成纤维细胞中的表达　　 目的：构建衰变加速因子(hDAF)基因与红色荧光蛋白(red fluorescentprotein,RFP)基因融合表达载体pDsRed2-C1-hDAF的并在小鼠成纤维细胞表达的研究以验证其有效性。　　 方法：提取人总RNA，反转录后以cDNA为模板PCR扩增hDAF基因，连接至pMD18-T载体后进行EcoRⅠ、SmaⅠ双酶切，回收酶切片段后插入pDsRed2-C1，构建融合表达载体后转染小鼠成纤维细胞。　　 结果：结果表明成功克隆了hDAF基因并构建了融合表达载体pDsRed2-C1-hDAF。采用脂质体法转染小鼠成纤维细胞48h后观察到RFP阳性细胞。对RFP阳性小鼠成纤维细胞进行PCR及Western blot，检测DAF基因的整合及表达情况。PCR结果表明hDAF基因整合入小鼠基因组。Western blot检测到了hDAF基因的表达。表明成功构建了融合表达载体pDsRed2-C1-hDAF，并可应用于进一步转基因研究。　　 第五部分、利用精子介导法建立hHT/hDAF双基因转移小鼠模型　　 目的：建立hHT/hDAF双基因转移小鼠模型，为探讨超急排斥反应(hyperacute rejection，HAR)及延迟性异种排斥反应(delayed xenograft rejection，DXR)的分子调控机制奠定基础。　　 方法：采用优化的精子介导法(Sperm-mediatedgene transfer，SMGT)制备转基因胚胎，进行胚胎移植后建立hHT/hDAF双基因转移小鼠模型并进行分子生物学检验。　　 结果：结果表明应用树枝状聚合物(Dendrimers)优化SMGT后，2细胞胚GFP+RFP的阳性率达到4.51％，同对照组相比差异极显著(P＜0.01)。选取标记基因GFP+RFP双阳性的胚胎进行移植后获得36只仔鼠，PCR及Southern blot检测结果表明，17只小鼠PCR结果呈hHT+hDAF双阳性，其中5只小鼠Southern blot结果呈hHT+hDAF双阳性。上述结果证实成功建立了hHT/hDAF双基因转移小鼠模型。