论文部分内容阅读
背景与目的鲍曼不动杆菌是常见的条件致病菌,属非发酵革兰阴性杆菌,广泛分布于自然界。由于对外界环境如湿热、紫外线、化学消毒剂有较强的抵抗力,因此容易引起多种医院感染。近年来由于抗菌药物的滥用,鲍曼不动杆菌的耐药率居高不下,由多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)引发的感染性休克会导致患者极高的病死率。去甲肾上腺素(NE)是一种儿茶酚胺类激素,是临床上用于治疗感染性休克的一线血管活性药物,有助于恢复组织灌注。但有研究发现,儿茶酚胺类激素可以促进细菌的生长及相关毒力,其中NE由于对多数细菌有显著的促生长效果而研究最多。已有研究报道,NE可以显著促进ATCC 17978及临床MDR-AB菌株的生长,在治疗MDR-AB感染引起的感染性休克中可能存在不利作用,但不同浓度NE对鲍曼不动杆菌生长及生物膜形成的具体影响仍有待研究。因此,我们通过体外培养鲍曼不动杆菌,以观察NE对鲍曼不动杆菌生长及生物膜形成的影响。方法1.本实验采用鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC 19606以及临床分离MDR-AB菌株,在模拟体内营养贫瘠环境的血清SAPI培养基中进行培养,测定两种菌株在不同浓度(25μM、50μM、100μM、200μM、500μM)NE存在下的24h生长曲线。2.分别测定ATCC 19606和MDR-AB菌株在NE作用前后对肺泡上皮细胞A549的黏附侵入能力。3.用结晶紫染色法、激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)以及扫描电镜(SEM)观察NE对ATCC 19606和MDR-AB菌株生物膜形成的影响。4.通过实时定量PCR(RT-q PCR)法测定ATCC 19606和MDR-AB菌株在NE作用前后黏附和生物膜相关基因aba I、csu A/B、bap、omp A和pga A基因的表达。5.微量肉汤稀释法测定NE作用前后左氧氟沙星(LEVO)、美罗培南(MEM)及多黏菌素B(PB)对ATCC 19606和MDR-AB菌株的最低抑菌浓度(MIC)。6.测定NE作用前后,ATCC 19606和MDR-AB菌株在1/4MIC、1/2MIC及MIC浓度的LEVO和MEM作用下的OD600值。7.对MDR-AB菌株进行基因组重测序,比较ATCC 19606和MDR-AB菌株基因组的差异。结果1.时间生长曲线表明,NE促进了ATCC 19606和MDR-AB菌株的生长,而对两种菌株表现出不同的促生长情况。500μM NE最大程度促进了两种菌株的生长,在接种2h后已产生显著的促生长作用(ATCC 19606,P<0.05;MDR-AB,P<0.01);200μM NE分别从4h和2h开始显著促进ATCC 19606和MDR-AB菌株的生长(P均<0.05);100μM NE从12h开始显著促进ATCC 19606菌株的生长(P<0.01),而从4h开始促进了MDR-AB菌株的生长(P<0.05);25μM和50μM NE基本不影响两种菌株24h内的生长。考虑药物用量、作用程度和作用时间,采用200μM浓度的NE进行后续实验。2.NE作用前后ATCC 19606和MDR-AB菌株对肺泡上皮细胞A549的黏附侵入能力没有变化。3.利用结晶紫染色法、CLSM及SEM均观察到NE促进了MDR-AB菌株生物膜的形成,而对ATCC 19606菌株的生物膜形成没有明显影响。4.ATCC 19606和MDR-AB菌株在NE作用下,csu A/B和bap基因的表达显著上调(P<0.01),aba I基因的表达均显著下调(P<0.01),omp A和pga A基因在ATCC 19606菌株中表达上调(P<0.01),但在MDR-AB菌株中表达下调(P<0.01)。5.NE作用前LEVO、MEM和PB对ATCC 19606菌株的MIC分别为1μg/ml、0.5μg/ml和0.5μg/ml,对MDR-AB菌株的MIC分别为64μg/ml、64μg/ml和0.5μg/ml;NE作用后LEVO、MEM和PB对ATCC 19606菌株的MIC分别为1μg/ml、0.5μg/ml和1μg/ml,对MDR-AB菌株的MIC分别为64μg/ml、64μg/ml和1μg/ml。NE没有改变LEVO和MEM对ATCC 19606和MDR-AB菌株的MIC,但将PB对两种菌株的MIC提高了一倍。6.在NE作用前1/4MIC浓度的MEM作用下MDR-AB菌株的OD600值在NE作用24h后没有显著变化,除此之外,在NE作用前MIC、1/2MIC、1/4MIC浓度的LEVO和MIC、1/2MIC浓度的MEM作用下ATCC 19606和MDR-AB菌株的OD600值在NE作用24h后均显著提高。7.与ATCC 19606菌株基因组相比,MDR-AB菌株基因序列读长(Reads)的比对率为81.24%,平均覆盖深度为162。单核苷酸多态性(SNP)总数为54780个,其中转换SNP为40388个,颠换SNP为14392个。插入缺失序列(In Del)总数为593个,其中编码插入的In Del有306个,编码缺失的In Del有287个。结构性变异(SV)总数为21个,其中缺失类型的SV有18个,染色体内部迁移的SV有3个。结论1.NE可以促进ATCC 19606和临床分离的MDR-AB菌株的生长。2.NE不影响ATCC 19606和MDR-AB菌株对肺上皮细胞A549的黏附侵入。3.NE可以促进MDR-AB菌株生物膜形成,但对ATCC 19606菌株的生物膜形成没有影响。两种菌株csu A/B和bap基因的表达在NE作用下均上调,但两种菌株对NE的不同反应性可能涉及其它基因表达的变化。4.NE没有改变LEVO和MEM对ATCC 19606和MDR-AB菌株的MIC,但提高了两种菌株在LEVO和MEM作用24h后的菌量(OD600值升高)。尽管NE将PB对两种菌株的MIC提高了一倍,但根据2020年美国抗菌药物敏感性试验委员会(USCAST)推荐的PB临床折点(敏感:≤2mg/L;耐药:≥4mg/L),两种菌株对PB的敏感性试验结果在NE作用后均为敏感,与NE作用前相比没有发生改变。5.ATCC 19606和MDR-AB菌株对NE反应性的不同可能与两种菌株基因组序列差异有关。