维氏气单胞菌作为一种人鱼共患致病菌,可引发多种疾病,严重威胁鱼类养殖业和人类的生命健康。本课题前期研究表明,维氏气单胞菌中的全局转录调控因子ArgR不仅参与精氨酸代谢调控,还通过与反式翻译系统互作,进而影响细菌致病性。本研究旨在进一步探究ArgR在维氏气单胞菌中发挥的功能,并挖掘其下游调控靶标和信号通路,从而为维氏气单胞菌致病性的分子机制研究提供更深入的理论基础。通过转录组分析比较ArgR缺失株与野生型的基因表达差异,发现与鞭毛合成相关的52个基因中,共有24个基因表达下调;同时通过分析差异表达基因在基因组上的定位,并结合鞭毛级联调控网络分析,推测ArgR的下游靶标为flrBC双组分系统,其通过调控flrBC双组分系统的表达,进而影响鞭毛结构基因表达。本研究从以下方面验证上述假设。首先,本研究鉴定ArgR蛋白作为转录因子,与flrBC双组分系统的启动子特异性结合并正调控其启动子转录活性。一方面,通过细菌单杂交实验和EMSA实验证明ArgR能够在体内和体外与PflrBC启动子相互结合;另一方面,通过q RT-PCR和荧光测定实验证明,ArgR敲除导致flrBC基因表达下调,且ArgR和PflrBC-EGFP共表达时可促进PflrBC启动子下游的绿色荧光强度显著提高,说明ArgR正调控PflrBC启动子转录活性;进一步通过将预测的结合位点突变后以EMSA检测ArgR与PflrBC的结合位点,发现PflrBC上突变的富AT区为二者发生结合的主要区域。其次,本研究从细菌表型分析入手,证明flrBC双组分系统影响维氏气单胞菌生物膜形成和运动性。采用同源重组基因敲除手段构建Δflr B、Δflr C、ΔflrBC三个基因敲除菌株,然后检测Δflr B、Δflr C、ΔflrBC、Δarg R四个菌株的生物膜形成与运动性,结果表明Δflr B、Δflr C、ΔflrBC的生物膜形成能力和运动能力均显著降低。最后,本研究初步分析ArgR对flrBC双组分系统的调控机制在其他细菌种类中的保守性。序列比对发现,在典型的极性鞭毛细菌霍乱弧菌中,PflrBC中具有三个ArgR保守结合基序;在Flr BC同源系统铜绿假单胞菌的Fle SR启动子中发现两个ArgR保守结合基序。序列分析暗示,ArgR对flrBC双组分系统的互作模式可能也存在于其他极性鞭毛细菌中,该互作关系具有一定保守性。本研究首次在维氏气单胞菌中探究ArgR的下游调控通路,补充了以ArgR为核心的调控网络,拓展了ArgR的功能。ArgR通过正调控flrBC的转录活性,进而影响维氏气单胞菌的生物膜形成和运动能力,这两种能力均与毒力高度相关。本研究的结果为研究全局转录调控因子ArgR的功能和极性鞭毛合成调控网络奠定了理论基础,也为研究维氏气单胞菌致病机制提供了新的视角。