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目的观察腺病毒介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在小鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)中的表达情况。方法1细胞分离培养及鉴定准备4只3~4周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠,采用颈椎脱臼法将小鼠处死,在超净台中操作,提取位于两侧腹股沟处的脂肪组织,用1%胶原酶充分消化,获得单细胞悬液,接种在培养瓶,进行原代小鼠脂肪干细胞及传代培养。对细胞形态进行观察,用CCK-8试剂法测定细胞生长曲线,采用流式细胞术对细胞表型进行鉴定,成脂成骨诱导对细胞分化潜能进行鉴定。2细胞分组及转染选取生长旺盛的第3代ADSCs,随机分成3组:空白组:将DMEM作为对照加入ADSCs培养瓶,空载组:以空病毒Ad-GFP转染ADSCs,实验组:以重组腺病毒Ad-hFⅨ转染ADSCs。将携带hⅨ基因的腺病毒转染小鼠脂肪干细胞,将转染后的ADSCs与未转染时细胞形态及生长曲线进行对比,观察两组之间有无变化。3转染后细胞检测采用RT-PCR检测细胞中hFⅨ基因的表达情况,应用Western blot检测细胞内以及培养细胞上清液中hFⅨ蛋白的表达。采用ELISA法测定细胞上清中的hFⅨ蛋白量(FⅨ:Ag),一期法检测培养细胞上清液中hFⅨ蛋白活性(FⅨ:C)。结果1细胞形态及生长曲线小鼠ADSCs离体培养最初几小时呈体积较小的圆球形,具有很强的折光性,贴壁生长时间为种瓶后4~6小时,细胞变为长梭形纤维状为种瓶后72 h,漩涡状排列;第3代ADSCs体外培养1~2天生长速度较缓慢,3~5天增殖速度增快,呈指数倍扩增,6~7天生长速度逐渐缓慢,总体生长趋势呈S型;2成脂成骨诱导油红O对诱导后细胞进行染色,用倒置显微镜观察,可见红色脂滴形成。茜素红对诱导后细胞进行染色,用倒置相差显微镜观察,可见橙红色钙化骨节。3流式细胞表型鉴定第3代ADSCs高表达CD29(99.91%),CD90(99.02%),几乎不表达CD45(0.94%)。4病毒转染取MOI=300,病毒转染后24h、48h、72h后,观察细胞表达GFP强度,发现细胞表达GFP最强时间在转染后72h,转染效率可达80%以上。观察ADSCs与未转染时形态无明显改变。5细胞mRNA的表达RT-PCR结果显示hFⅨ基因可以在小鼠脂肪干细胞内表达。6细胞内及上清中hFⅨ蛋白表达Western blot结果显示小鼠脂肪干细胞内及培养细胞上清液中均可表达hFⅨ蛋白。7转染细胞FⅨ:Ag检测ELISA测定转染ADSCs培养上清FⅨ:Ag:第1d为21.33±3.93 g/(10~6cells·24h),第3d为12.63±0.86ng/(10~6cells·24h),第9d为12.63±2.36 ng/10~6cells·24h)。8 FⅨ:C检测一期法检测培养细胞上清液中FⅨ:C为8.5%。说明腺病毒能够成功转染小鼠脂肪干细胞使其分泌hFⅨ蛋白,为后续细胞疗法治疗血友病B奠定了基础。结论1携带hFⅨ基因的腺病毒能有效转染ADSCs;2 hFⅨ基因修饰的ADSCs可以分泌具有凝血活性的hFⅨ蛋白。图10幅;表4个;参68篇。