卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，死亡率占据妇科恶性肿瘤首位，预后差。经典的血管生成理论不能解释单纯以血管内皮细胞为靶标的抗血管生成治疗疗效欠佳。血管生成拟态是近年来发现的存在于部分高度恶性肿瘤的一种新的血液供应方式，指肿瘤细胞在没有血管内皮细胞的参与下，肿瘤细胞表型出现转化，通过自身变形和基质重塑直接形成特有的微循环管道，可表达血管内皮细胞标记。课题组前期实验已在体外通过缺氧诱导卵巢上皮性癌细胞在三维支架上生长分化为内皮样细胞并形成拟态微管道。HIF-1α抑制剂雷帕霉素在体外能遏制卵巢癌拟态血管形成。但卵巢癌血管生成拟态的体内研究甚少。本课题以慢病毒载体转染卵巢癌细胞标记绿色荧光蛋白，建立裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤模型，应用光镜、电镜、荧光显微镜观察卵巢癌组织拟态血管的形态，应用免疫组化、免疫荧光化学、流式细胞仪检测、RT-PCR、Western Blot等技术检测体内卵巢癌细胞血管内皮细胞标记CD31等的表达。应用雷帕霉素、MMP2抑制剂舒林酸观察其对拟态血管形成和卵巢癌细胞可塑性表达血管内皮细胞标记的影响。课题分三个部分：1、卵巢癌细胞株可塑性形成拟态血管的体内研究；2、卵巢癌血管生成拟态与HIF-1α、VEGF表达的关系；3、雷帕霉素和舒林酸对卵巢癌血管生成拟态的影响。第一部分卵巢癌细胞株可塑性形成拟态血管的体内研究目的：检测人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3ip、ES-2移植裸鼠腹腔成瘤后血管生成拟态的形成和分子塑形的改变。方法：采用慢病毒载体转染SKOV3ip、ES-2细胞携带绿色荧光蛋白，接种裸鼠腹腔成瘤后，HE染色、电镜、荧光显微镜观察肿瘤组织切片中拟态血管的形态，肿瘤原代培养后，应用流式细胞仪检测卵巢癌细胞血管内皮标记CD31、Ⅷ因子、VEGF的体内表达，应用免疫组化、免疫荧光化学、RT-PCR、Western Blot等技术检测CD31的表达，检测SKOV3ip、ES-2细胞的乙酰化低密度脂蛋白Dil-acLDL吞噬功能。结果：SKOV3ip、ES-2细胞裸鼠腹腔内成瘤后可形成血管生成拟态，即肿瘤细胞在没有宿主鼠血管内皮细胞参与，形成特有的腔隙样管道，内见红细胞。SKOV3ip在体内可表达微量的CD31、Ⅷ因子，ES-2细胞可表达微量的CD31、Ⅷ因子、VEGF，并具有Dil-acLDL吞噬功能。结论：人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3ip、ES-2在体内具有可塑性，能表达部分血管内皮细胞的特异性抗原，在体内形成血管生成拟态。第二部分肿瘤血管生成拟态与HIF-1α、VEGF表达的关系目的：测定裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤中央和边缘区域HIF-1α、VEGF的表达差异，探讨体内拟态血管发生的可能相关因素。方法：建立裸鼠卵巢浆液性癌和卵巢透明细胞癌的腹腔移植瘤模型，分别取材肿瘤中央和边缘区域的无坏死组织，通过连续切片HE染色观察血管生成拟态的形成，应用免疫组化、实时定量PCR等技术检测HIF-1α、VEGF在肿瘤中央和边缘区域的表达差异。结果：在卵巢癌组织中央区域可见肿瘤细胞围成的腔道，未见血管内皮细胞衬覆，而肿瘤周边区域只见内皮细胞依赖性血管，未见肿瘤细胞围成的血管。卵巢癌组织中央区域的HIF-1α、VEGF蛋白以及HIF-1α、VEGFmRNA的表达水平均显著高于肿瘤周边组织，差异有统计学意义(P＜0.05)。相关性分析提示卵巢癌组织中HIF-1α蛋白表达水平与拟态血管形成有相关性(P＜0.05)。结论：拟态血管仅存在于裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤组织的中心区域，肿瘤组织中央区域的HIF-1α和VEGF表达水平明显高于肿瘤周边组织，HIF-1α表达与拟态血管形成相关。卵巢癌血管生成拟态可能是肿瘤为适应其内部缺氧微环境而产生的一种血液供应模式。第三部分雷帕霉素和舒林酸对血管生成拟态的影响目的：探讨HIF-1α抑制剂雷帕霉素和MMP2抑制剂舒林酸在体内对卵巢癌拟态血管形成及卵巢癌细胞分子塑形的影响。方法：建立裸鼠浆液性卵巢癌腹腔移植瘤模型，随机分为6组，分别在种植肿瘤细胞第2天和成瘤直径接近1cm时开始腹腔注射雷帕霉素；同样时间点分别开始舒林酸灌胃；对荷瘤鼠给予生理盐水为阴性对照组；对荷瘤鼠给予顺铂为DDP对照组。检测各组抑瘤率，HE染色观察拟态血管的形成，流式细胞仪检测肿瘤细胞表型CD31、Ⅷ因子的表达，应用RT-PCR和Western blot检测肿瘤HIF-1α、VEGF、MMP2表达。结果：雷帕霉素早期腹腔注射后，可抑制肿瘤的生长，肿瘤组织的HIF-1α、VEGF在mRNA和蛋白水平均有明显下降(P＜0.05)，而成瘤后再注射雷帕霉素，肿瘤的HIF-1α、VEGF的表达略有降低，但变化无统计学意义。雷帕霉素早期腹腔注射后，肿瘤细胞表达血管内皮细胞标记CD31、Ⅷ因子的比率显著降低(P＜0.01)，HE染色观察也未见拟态血管。舒林酸早期灌胃可以抑制卵巢腹腔移植瘤的生长，HE染色未发现肿瘤细胞形成拟态血管。肿瘤组织的MMP2、VEGF在mRNA和蛋白水平均有显著下降(P＜0.05)，而成瘤后再灌注舒林酸，MMP2、VEGF表达则无明显降低。Spearman’s分析提示HIF-1α蛋白表达水平与CD31表达有相关性(P=0.025，r=0.733)，Ⅷ因子与HIF-1α蛋白表达水平有相关性(P=0.047，r=0.997)。HIF-1αmRNA与VEGFmRNA表达水平有相关性(P=0.002，r=1.000)。结论：雷帕霉素早期应用可抑制HIF-1α和VEGF表达，卵巢癌细胞向血管内皮样细胞分化的能力下降，抑制了血管生成拟态的发生。舒林酸可能抑制拟态血管的发生，但随着舒林酸使用时机的延后，其调节MMP2的能力相应降低。综上所述，裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤组织中心缺氧严重的卵巢癌细胞在体内能可塑性转化成血管内皮样细胞，形成血管生成拟态。雷帕霉素、舒林酸可能抑制卵巢癌细胞分子塑性的改变和血管生成拟态的发生。本课题为进一步研究肿瘤血管生成拟态提供了新的思路，可为卵巢癌抗血管治疗提供新的理论依据和治疗靶标。