研究背景与实验目的白头翁Pulsatilla chinensis (Bge.) Regel为毛莨科白头翁属植物白头翁的干燥根,主要含五环三萜皂苷类成分,本课题组的前期研究初步发现白头翁皂苷碱水解后抗肿瘤活性显著提高,具体原因有待深入研究。初步推测白头翁碱水解后主要皂苷类成分发生了较大变化并导致碱水解产物活性增强。因此,为阐明白头翁碱水解总皂苷的主要活性物质基础并为下一步抗肿瘤新药开发提供数据参考,拟从以下几个方面开展研究：(1)对白头翁碱水解总皂苷进行系统分离,得到并确认白头翁碱水解总皂苷的主要成分；(2)结合体内外活性测定确认主要成分的体内外抗肿瘤活性；(3)对其中含量最高且活性明确的成分的从药代动力学参数、组织分布情况、体内排泄情况、体内外代谢等角度评价其成药性,为下一步剂型选择、结构修饰等工作提供参考。本研究的最终目的是为白头翁抗肿瘤有效部位中药5类新药开发以及进一步寻找中药1类抗肿瘤新药候选化合物或者先导化合物奠定基础。研究方法1.采用有机溶剂提取、碱水解反应、大孔树脂分离等手段得到白头翁碱水解总皂苷,并通过运用中压ODS制备液相等技术,系统分离得到白头翁碱水解总皂苷中的主要成分,结合UHPLC-Q-TOF-MS(超高效液相-三重四级杆飞行时间质谱),对主要成分进行进一步的结构确证,同时利用Triple TOFTM 5600高分辨率质谱自带的Peakview 1.2软件利用化合物精确分子量提取其相对峰面积,初步确认其中含量最高的成分。2.对白头翁碱水解总皂苷中含量最高的成分(B3)体内外抗肿瘤活性进行评价。体外实验：采用MTT实验研究B3对11种肿瘤细胞的增殖抑制活性；体内实验：建立KM小鼠H22肝癌模型,研究B3对荷瘤小鼠肿瘤生长抑制、体重以及免疫器官的影响(脾脏指数、胸腺指数)。3.采用LC-MS/MS技术,严格按照《SFDA化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》并适当参照FDA生物样品分析指导原则,建立B3在血浆中的样品测定方法。4.利用LC-MS/MS方法测定大鼠灌胃、尾静脉注射给予不同剂量的B3后的血药浓度,建立药时曲线,并利用Winnolin 6.1软件分析药动学参数,得到B3灌胃及静脉注射在体内的药代动力学特征及生物利用度等参数并进行分析。5.初步建立B3在大鼠各组织中的LC-MS/MS测定方法,了解大鼠尾静脉注射B3后在体内各组织中的分布情况,初步阐明了B3在各组织中的分布特点及组织中药物浓度随时间的变化规律及蓄积情况。6.初步建立B3在大鼠尿液、粪便、胆汁中的LC-MS/MS测定方法,对B3尾静脉注射给药后在大鼠尿液、粪便、胆汁中的排泄情况进行了研究。7.建立UHPLC-Q-TOF/MS方法对B3在大鼠粪便、尿液、给药后不同时间点血浆中的主要代谢产物进行鉴定,了解B3在体内的生物转化过程、阐明其体内作用机制。8.建立体外肠道菌群孵育体系,利用UHPLC-Q-trap-MS技术,对B3在大鼠体外肠道菌群中的代谢产物进行了鉴定,了解B3在体外肠道菌群中的生物转化过程。研究结果1.从白头翁碱水解总皂苷中共分得到P1-P6共6个化合物,结合UHPLC-Q-TOF-MS对6个化合物在白头翁碱水解总皂苷中的峰进行结构确认并采用Triple TOFTM 5600自带的Peakview 1.2软件利用化合物精确分子量提取其相对峰面积,确认了含量最高的化合物化学名为3-O-a-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[p-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷(B3),单次分离得到B3量约为2.5 g,经过反复上柱分离累积得到B3约25 g。2.B3体外抗肿瘤实验结果显示：采用MTT法,B3对各种受试细胞的生长抑制效应均呈现出良好的浓度依赖关系,对各种受试细胞的半数抑制浓度(IC50)均值范围：1.94-9.47 μg/mL;B3体内抗肿瘤实验结果显示：B3(2.5,5,7.5mg/kg,腹腔注射)以B3 (100,200mg/kg,灌胃给药)能明显降低H22小鼠瘤重,对小鼠肝癌生长的抑制率分别为45.42%、51.01%、71.75%以及57.94%、69.13%,呈现较好的剂量效应关系。B3各受试药物组对荷瘤小鼠红细胞、血红蛋白、血小板无明显的影响,与模型组比较无统计学意义,说明B3对骨髓造血功能的无影响。本次试验说明B3具有较强的体内外抗肿瘤活性,且毒性较小。3.建立了B3在血浆中的样品测定方法,该方法分析时间在2.5min以内,线性范围为2.00-2000 ng/mL,样品处理方法简单,完全满足B3体内样品生物分析的需要,为下一步对B3在体内的药代动力学、组织分布、排泄进行研究奠定了良好的方法学基础。4.药动学及生物利用度研究结果：(1)灌胃给药药动学结果：大鼠分别灌胃低、中、高(60mg/kg,120 mg/kg,240 mg/kg)三个剂量B3后,吸收较快,各剂量组都被后迅速吸收,胃及消化道上段可能是其主要吸收部位,消除较慢。三个剂量AUClast(比值(1：0.47：1.41)min与剂量之比(1：2：4)不呈线性,t1/2(半衰期)与给药剂量之间没有规律,说明B3的口服吸收为非线性动力学过程,而且B3在体内的吸收可能存在饱和的过程,三个剂量组Vz_F_obs(表观分布容积)较大,药物可能与某些特定组织亲和力比较大(2)尾静脉注射给药药动学结果：大鼠尾静脉注射B3低、中、高(0.625 mg/kg,1.25 mg/kg,2.5 mg/kg)三个剂量后B3后消除较慢,AUClast(比值(1：3.5：11.3)与剂量之比(1：2：4)不呈线性,三个剂量组Vz_F_obs(表观分布容积)较大,说明尾静脉注射B3后,同灌胃结果。(3)生物利用度：B3灌胃在大鼠体内的绝对生物利用度为0.22%,生物利用度低。5.大鼠静脉注射B3后在肺、肝、脾、肾等几个组织中分布较高,提示该药物对上述组织有较好的的亲和力,尤其是在所选定的在三个时间中,肺和肝组织中浓度均高于其他组织,在各肠段中(十二指肠、空肠、回肠、结肠),药物对结肠的亲和力较高,表现为结肠部位的组织浓度最高,提示该药物对结肠癌可能有较好的作用。6.SD大鼠静脉注射给药B3后,在胆汁、粪便和尿液中的原药的累积排泄率分别是0.11%、9.37%和0.42%。提示B3主要通过大鼠粪便,B3原型总排泄率低于10%。7.应用UHPLC-Q-TOF-MS在大鼠粪便、尿液以及不同时间点血浆中共鉴定了(M1-M18)共18个代谢产物,其中有8个确定为首次报道,说明B3进入体内后经历了广泛的代谢。8.利用UHPLC-Q-trap-MS技术在大鼠离体肠道菌群孵育样品中鉴定了M0(B3,原型)以及(M1-M7)共7个体外代谢产物,说明B3能够被大鼠离体肠道菌群孵代谢。结论1.与文献研究结果一致,白头翁碱水解总皂苷活性明显增强,应该与碱水解以后大量的C-28苷化的皂苷转化为28-COOH有关。对白头翁碱水解总皂苷进行了系统分离,得到了其中6个主要的皂苷类化合物,均为C-28未被苷化的单糖链皂苷,利用UHPLC-Q-TOF/MS方法对6个皂苷在总皂苷中的峰进行了指认并确定了其相对峰面积,并初步确认B3为其中含量最高的主要成分。2.B3不仅为白头翁碱水解总皂苷的主要成分,而且为其中的主要抗肿瘤活性成分。体外抗肿瘤实验表明B3具有较强的体外抑制肿瘤细胞增殖的作用。体内抗肿瘤实验结果也提示：B3能明显降低H22小鼠瘤重,呈现较好的剂量效应关系；B3对骨髓造血功能的没有影响。3.药代动力学研究结果表明,与其他皂苷化合物一样,B3的体内绝对生物利用度很低(仅为0.22%)。大鼠灌胃B3后血药浓度显示个体差异极大,各给药浓度的个体达峰时间和达峰浓度的变异很大,提示其口服吸收很不规则,所以在选择B3给药方式或者剂型时要特别注意提高其生物利用度或者选择非口服的剂型。另外,B3在体内可能不仅是以原型的方式起效,体内应该还存在其他活性代谢产物。B3灌胃和尾静脉注射两种给药方式表观分布容积都比较大,B3可能在某些特定器官有亲和力,可能对某些组织的实体肿瘤有靶向的作用。4.B3在体内原型排泄量很低,在体内存在广泛的代谢转化。排泄研究的结果表明,鼠静脉注射给药B3后,在胆汁、粪便和尿液等主要排泄途径中的原型的累积排泄率分别是0.11%、9.37%和0.42%,提示B3主要通过大鼠粪便排泄。此外,B3原型累计排泄率不足10%,还有大量的B3不知去向,还需进一步的代谢研究。5.B3在体内存在广泛的生物转化。通过建立的UHPLC-Q-TOF/MS方法对B3在大鼠粪便、尿液、不同时间点血浆中的主要代谢产物进行了鉴定,鉴定了(M1-M18)共18个代谢产物,其中有8个确定为首次报道。B3在体内的主要代谢产物为B3异构化的产物(M1)及常春藤皂苷元(M7),这两个成分也是除B3原型以外,是B3代谢产物中主要入血成分,这些入血成分极有可能是B3的起效成分。本次试验初步也确定了B3在体内的代谢途径,同时为其他五环三萜类化合物体内代谢研究提供了参考。6.B3体外肠道菌群中能够对发生广泛的代谢。B3属于五环三萜类皂苷,这一类皂苷最主要的特点就是活性很强,但是生物利用度较低,其中肠道菌群的外排和代谢起到非常重要的作用,某些代谢产物可能是其发挥活性的关键。对B3在体外肠道菌群中的代谢产物研究表明,B3在肠道菌群的7个代谢产物,其中有5个同时在体内代谢试验中发现,但是另外有2个甲基化代谢产物未在体内代谢产物中发现。综上所述,B3原料来源充足、活性明确,其药代参数和组织分布情况已经初步明确,体内代谢过程得到初步阐明,值得作为抗肿瘤候选化合物或者先导化合物进行深入的开发。