前列腺癌是男性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一。根据2022年的最新数据,前列腺癌的发病率占男性恶性肿瘤的第一位,死亡率占第二位。前列腺癌具有高度异质性,大多数相对惰性,进展较缓慢,只有10-15%的前列腺癌为侵袭性癌,且许多侵袭性前列腺癌患者在首诊时,已发生广泛的远处脏器转移,预后极差。在治疗方面,针对局限性前列腺癌,临床上通常选择根治性前列腺切除术（Radical prostatectomy,RP）。目前,进展期前列腺癌的治疗手段主要为雄激素剥夺治疗（Androgen deprivation therapy,ADT）,但大多数患者经过1～3年的治疗后会出现生化复发,逐渐发展为去势抵抗性前列腺癌（Castration-resistant prostate cancer,CRPC）。欧洲泌尿学协会建议将初次接受RP治疗后的局限性前列腺癌患者前列腺特异性抗原（Prostate Specific Antigen,PSA）水平升高＞2ng/mL定义为生化复发。RP术后PSA升高的患者10年内发生远处转移的几率约为60%,死于前列腺癌的几率为20%。如何精准判定前列腺癌的“惰性（Indolent）”与“侵袭性（Aggressive）”,预测哪些前列腺癌患者更易出现生化复发,倾向于进展至CRPC,以及如何对RP术后生化复发的患者进行更好的诊断和治疗来延缓疾病的进展,均是临床关注的重要问题。因此,有关前列腺癌进展过程的关键分子机制亟需进一步阐明。性别决定区 Y-box 4（Sex-determining region Y-box 4,SOX4）基因是 SOX 转录因子家族C亚群中的一员。目前已证实SOX4基因在乳腺癌、膀胱癌、肺癌等多种恶性肿瘤中高表达。此前,我们课题组与他人研究发现,SOX4过表达导致我国前列腺癌患者预后不良,体内外实验证明SOX4促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。SOX4和融合基因TMPRSS2-ERG在前列腺癌中协同促进其上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）。此外,我们 最新研 究发现 SOX4 可能 通过调控微小RNA（microRNAs,miRNAs）及其下游靶基因促进前列腺癌细胞的神经内分泌转化。PTEN基因是重要的抑癌基因。前列腺癌的发生发展及其雄激素非依赖性转变的过程与PTEN基因的表达缺失相关。已有研究报道,PTEN蛋白的表达与前列腺癌的病理分级、临床分期和Gleason评分呈明显负相关,提示PTEN蛋白的表达水平可随前列腺癌恶性程度的增加而降低。PTEN的缺失或蛋白表达失活可以激活PI3K-AKT信号通路,导致前列腺癌的发生发展并促使其向CRPC转变。另外,有研究显示SOX4是维持PI3K-AKT信号通路活性所必需的。为进一步深入研究SOX4在前列腺癌恶性进展中的作用和分子机制,我们首先使用前列腺癌公共数据库 GEO（Gene Expression Omnibu）和 TCGA（The Cancer Genome Atlas）分析发现SOX4的表达水平随着前列腺癌进展而逐渐增高。SOX4 mRNA表达水平高的前列腺癌患者具有较高的生化复发风险。重要的是,基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）分析前列腺癌公共数据库,结果显示PI3K-AKT信号通路激活可能在前列腺癌生化复发中发挥重要作用,并且PTEN可能是SOX4的下游靶基因。另外,通过分析GEO和TCGA前列腺癌公共数据库,我们发现在mRNA水平上,SOX4和PTEN表达呈显著负相关。在此基础上,我们构建了三个组织芯片（Tissue microarray,TMA）,共包括206例RP术后前列腺癌患者的肿瘤标本。免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）结果显示在前列腺癌患者中SOX4与PTEN蛋白表达水平均呈负相关。同时高表达SOX4和低表达PTEN（SOX4+/PTEN-）的病例在生化复发的前列腺癌中比例显著增加,而同时低表达SOX4和高表达PTEN的病例（SOX4-/PTEN+）在无生化复发的前列腺癌中比例较高,提示两者的相互作用可能在前列腺癌患者生化复发及恶性进展中发挥重要作用。为验证这一假设,通过对前列腺癌公共数据库的聚类分析,我们发现SOX4+/PTEN-前列腺癌患者明显富集在侵袭性前列腺癌组,且具有较高的生化复发风险,以上结果提示SOX4+/PTEN-前列腺癌可能是一个预后不良的侵袭性亚型。为进一步研究SOX4与PTEN之间具体的调控机制,我们首先使用Western blot检测SOX4在前列腺癌细胞系中的蛋白表达量,并结合PTEN在前列腺癌细胞系内的表达情况（PTEN野生型前列腺癌细胞VCaP、DU145）,选取SOX4表达最高的VCaP细胞进行siRNA敲低;选取SOX4表达最低的DU145细胞进行过表达。Western blot实验和qRT-PCR实验发现SOX4下调PTEN蛋白表达,而对PTEN mRNA水平无明显影响,以上结果提示SOX4可能在转录后水平调控PTEN蛋白的表达。进一步实验发现SOX4对PTEN的蛋白稳定性无明显调控作用。MiRNAs是一类内源性非编码RNA,一般通过与mRNA的3’-非翻译区（Untranslated region,UTR）相互作用,在转录后水平调控mRNA的翻译和稳定性。我们前期工作中发现SOX4作为转录因子,可以转录调节多种miRNAs表达。因此,我们提出假设,SOX4可能通过调控miRNAs表达而发挥下调PTEN蛋白的作用。利用公共数据库数据、送检siSOX4的miRNAs-seq芯片数据和TargetScan生物信息分析预测软件等,筛选出与SOX4相关并靶向PTEN的miRNAs,其中包括miR-106b～25簇（成员包括:miR-106b-5p、miR-93-5p、miR-25-3p）。他人研究发现 miR-106b～25 簇高表达可促进前列腺癌细胞增殖和迁移,并与前列腺癌患者预后不良相关,且miR-106b～25簇三个成员均可以靶向PTEN。接下来,我们通过分析GEO数据库,发现在前列腺癌患者中,miR-106b～25簇成员与SOX4表达水平呈显著正相关。qRT-PCR实验结果显示,在前列腺癌细胞VCaP、DU145中,SOX4上调miR-106b～25簇成员的表达。鉴于SOX4作为转录因子,我们假设SOX4可能转录调控miR-106b～25簇表达;qRT-PCR实验结果显示,SOX4上调前列腺癌细胞VCaP、DU145中pre-miR-106b～25簇成员的表达。已有文献报道,miR-106b～25簇位于MCM7基因的第13内含子中,提示miR-106b～25簇与其宿主基因MCM7共用同一启动子区域。另外,我们发现在前列腺癌患者中,SOX4和MCM7的mRNA表达水平呈正相关,且qRT-PCR实验结果证明SOX4同向上调MCM7和miR-106b～25簇。根据以上结果,我们猜测SOX4可能通过结合MCM7的启动子区来调节miR-106b～25簇。ChIP实验及双荧光素酶实验结果发现SOX4可以结合到MCM7的启动子区,从而转录上调miR-106b～25簇宿主基因MCM7的表达,继而发挥上调miR-106b～25簇成员表达的作用。Western blot实验和双荧光素酶实验证明miR-106b～25簇成员可直接结合于PTEN 3’-UTR区并负向调控PTEN蛋白的表达。拯救实验证明,miR-106b～25簇成员介导SOX4对PTEN蛋白的调控作用。最后,我们探讨了 SOX4和PTEN之间是否存在相互调控。Western blot实验结果表明PTEN可以下调SOX4蛋白在前列腺癌细胞中的表达。通过细胞拯救实验,MTS、EdU和Transwell实验进一步证实过表达PTEN可以部分逆转SOX4过表达所促进的前列腺癌细胞增殖、迁移和浸润能力。提示SOX4和PTEN形成负反馈环路促进前列腺癌进展。目前,PTEN-PI3K-AKT信号通路抑制剂,已经在三阴性乳腺癌、慢性髓系白血病、卵巢癌的治疗中取得进展。LY294002是已知的PI3K-AKT信号通路抑制剂。多项研究表明,LY294002可以抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。MTS、EdU和Transwell实验结果显示过表达SOX4可以增加DU145细胞对LY294002的耐药性,同时LY294002可部分逆转SOX4过表达引起的前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。综上所述,本研究首次证实SOX4高表达与前列腺癌生化复发相关,在前列腺癌患者中,SOX4与PTEN表达水平呈负相关,SOX4+/PTEN-前列腺癌可能是一个预后不良的侵袭性亚型。通过体外实验,我们发现并阐明SOX4可以通过转录上调miR-106b～25簇下调PTEN蛋白表达,且SOX4与PTEN之间可形成负反馈环路,促进前列腺癌的恶性进展。过表达SOX4后可以增加前列腺癌细胞对PI3K-AKT通路抑制剂耐药性。本研究使我们对前列腺癌进展过程的相关分子机制有了进一步的了解,并为前列腺癌的诊断和靶向治疗提供了新的理论依据和潜在靶点。