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集约化养殖密度的增加加重了家禽呼吸系统疾病压力。家禽肺损伤是严重的呼吸系统病症,通常由环境变化、应激、病原感染等多种因素引起。其发病机制受多细胞器、细胞因子和信号通路调控。内质网应激信号通路是介导气道结构细胞命运的重要途径,区别于其它两条调控细胞命运的线粒体途径和死亡受体途径。表观遗传学参与多种生命活动(细胞生长、分化、凋亡),旨在从分子水平解释临床症状。本研究中,我们利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)构建体外内质网应激(endoplasmic retieulumstress,ERS)模型,分析表观遗传修饰酶的表达变化及其生物学功能,并探讨黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)对LPS刺激的促炎性细胞因子的调控作用,以期为营养表观遗传调控肺部炎症反应奠定理论基础。试验一LPS诱导BEAS-2B细胞内质网应激模型的构建本试验首先检测LPS刺激BEAS-2B细胞ERS发生标志性蛋白免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein,BIP)的表达情况,构建ERS模型;其次,分析未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)信号通路蛋白肌醇需要酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)、蛋白激酶RNA样内质网激酶(the kinase PKR-like ER-resident kinase,PERK)和激活转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)的表达情况,探讨LPS对BEAS-2B细胞ERS的影响及作用机制。蛋白水平研究LPS添加对BEAS-2B细胞ERS相关蛋白表达的剂量-效应关系和时间-效应关系。剂量-效应关系的结果显示,100 ng/m L LPS、200 ng/m L LPS和500 ng/m L LPS以剂量依赖性方式增加BEAS-2B细胞中BIP蛋白的表达(P<0.01)。添加200ng/m L LPS、500 ng/m L LPS均能显著提高BEAS-2B细胞中PERK和IRE1α蛋白的表达(P<0.01),而不影响ATF6蛋白的表达(P>0.05)。时效关系结果显示,200ng/m L LPS诱导BEAS-2B细胞0 h、0.5 h、1 h、6 h、12 h和24 h。与空白对照组比较,200 ng/m L LPS诱导6 h,PERK蛋白表达上调(P<0.05),BIP和真核翻译起始因子2α(translational initiation factor 2αin eukaryotes,e IF2α)蛋白在LPS诱导12 h后表达明显上调(P<0.05),并具有时间依赖性,而磷酸化PERK只有在LPS诱导6 h时表达升高(P<0.05)。结果提示,适当LPS刺激BEAS-2B可成功构建体外ERS模型,UPR的两条信号通路PERK、IRE1α选择性活化。试验二PRMT1在PERK-e IF2α信号通路中的作用及机制研究本试验通过RT-q PCR、Western Blot方法研究LPS诱导BEAS-2B细胞蛋白质精氨酸N-甲基转移酶1(protein arginine N-methyltransferase 1,PRMT1)表达的量效关系和时效关系、细胞免疫荧光法检测PRMT1亚细胞定位情况,初步探讨PRMT1对BEAS-2B细胞ERS的影响;利用敲低和过表达PRMT1方法,研究PRMT1在PERK-e IF2α信号通路中的作用机制。剂量-反应关系结果显示,添加50 ng/m L LPS、100 ng/m L LPS、200ng/m L LPS和500 ng/m L LPS均降低BEAS-2B细胞PRMT1转录水平的表达(P<0.001);200 ng/m L LPS和500 ng/m L LPS降低PRMT1蛋白水平的表达(P<0.05)。时间-效应关系结果显示,在200 ng/m L LPS刺激BEAS-2B细胞1 h后,PRMT1蛋白的表达低于对照组(P<0.05),并且具有时间效应。Western Blot结果显示:10μM精氨酸N-甲基转移酶抑制剂1(arginine N-methyltransferase inhibitor-1,AMI-1)处理细胞12 h可抑制PRMT1蛋白水平的表达(P<0.05),但是对磷酸化的PERK无影响(P>0.05);过表达PRMT1质粒转染BEAS-2B细胞72 h,PRMT1转录水平和蛋白水平的表达均显著高于空载质粒组(P<0.01),PERK-e IF2α信号通路蛋白磷酸化PERK(P<0.01)及其下游e IF2α蛋白表达降低(P<0.05)。结果提示,PRMT1在PERK-e IF2α信号通路上游发挥作用。试验三APS对LPS诱导的BEAS-2B细胞体外抗炎作用的研究为了阐明LPS诱导的ERS在BEAS-2B细胞中的功能意义,APS对LPS诱导的体外BEAS-2B细胞的抗炎活性。该研究首先检测LPS浓度对BEAS-2B细胞数量和增殖能力的影响。因此,确定LPS添加剂量用于随后的抗炎试验研究。其次,RT-q PCR检测LPS、APS、LPS+APS组炎性细胞因子的表达情况。MTT结果显示,添加1μg/m L LPS降低BEAS-2B细胞的OD570值(P<0.001),而添加50 ng/m L LPS、100ng/m L LPS、200 ng/m L LPS和500 ng/m L LPS刺激BEAS-2B细胞24 h均无显著影响(P>0.05),因此选择200 ng/m L和500 ng/m L的LPS用于后续抗炎研究。转录水平结果表明,添加200 ng/m L LPS和500 ng/m L LPS可提高BEAS-2B细胞中TNF-αm RNA表达(P<0.05),200 ng/m L LPS+200μg/m L APS和500 ng/m L LPS+200μg/m L APS则无显著影响(P>0.05);添加200 ng/m L LPS和500 ng/m L LPS可使IL-1βm RNA表达显著提高(P<0.01),200 ng/m L LPS+200μg/m L APS添加无显著变化(P>0.05),而与500 ng/m L LPS处理组相比,500 ng/m L LPS+200μg/m L APS显著降低炎症因子IL-1β的表达(P<0.05)。结果表明:APS对LPS刺激BEAS-2B细胞具有抗炎保护作用,此作用可通过降低细胞炎症因子表达实现。综上,表观遗传修饰酶PRMT1参与LPS诱导的BEAS-2B细胞内质网炎症反应,且体外添加APS能够缓解此反应。