论文部分内容阅读
目的：体外利用融合PCR,针对人端粒酶hTERT基因外显子的三个不同区段分别构建可双向驱动的U6、H1双启动子siRNA表达载体,并针对其3端非翻译区构建一个U6、H1双启动子的miRNA表达载体。通过对肿瘤细胞端粒酶hTERT基因表达进行RNA干扰来验证此siRNA/miRNA表达载体的有效性,从而为siRNA/miRNA的制备以及为人肿瘤细胞基因抑制及基因治疗提供新的途径和方法。方法：分别以pSUPER质粒和pRNAT-U6.1/Neo质粒为模板,根据端粒酶hTERT基因（genebank （NM198253））外显子核酸序列2650-2668,2760-2778,3009-3027三个位点,及3＇端非翻译区3964-3982位点分别设计特异引物,利用融合PCR方法构建两端分别为U6和H1启动子,中间部分为上述的端粒酶hTERT特定序列,可双向转录的siRNA/miRNA表达载体。对照中间部分则为设计的随机序列。将表达载体产物纯化后用磷酸钙共沉淀法分别转染HepG2细胞和HeLa细胞,用TRAP-PCR银染法定性检测端粒酶活性,并对端粒酶活性电泳条带进行灰度扫描以及定量TRAP-PCR检测端粒酶活性抑制程度,验证U6、H1双启动子表达载体的RNA干扰作用。结果：PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳分析显示：第一阶段PCR反应产物单U6启动子正义表达载体片段、单H1启动子反义表达载体片段长度分别为366bp和245bp,第二阶段融合PCR反应产物U6、H1双启动子表达载体片段长度为592bp。将构建的五个双启动子表达载体产物纯化后分别转染入HepG2细胞和HeLa细胞,检测端粒酶活,结果显示：HeLa细胞转染构建的不同双启动子表达载体后,与对照相比,端粒酶活性呈现不同程度的降低。针对hTERT基因外显子核酸序列2650-2668,2760-2778,3009-3027三个位点和3＇端非翻译区3964-3982位点的U6、H1双启动子表达载体,端粒酶活性的抑制率分别为70.31%,36.80%,57.39%,80.47%; HepG2细胞转染上述双启动子表达载体后,各表达载体对端粒酶活性的抑制率分别为75.00%,67.35%,68.46%,81.80%；对照表达载体均无RNA干扰作用,端粒酶活性检测未见抑制。结论：利用融合PCR方法设计并成功构建针对hTERT基因的U6/H1双启动子siRNA及miRNA表达载体,并对HepG2细胞和HeLa细胞端粒酶的活性产生了有效的干扰作用。该siRNA/miRNA制备方法快速,成本低,不含质粒等外源DNA片断,可为高通量筛选有效干扰位点和建立RNAi文库开拓新的思路,为探索肿瘤端粒酶基因抑制的有效RNA干扰靶点提供参考。