第一章 基于EpCAM免疫磁珠法的CK19联合hMAM-QDs乳腺癌循环肿瘤细胞双标法的建立及临床价值研究背景和目的:乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤,死亡率高,肿瘤复发和转移仍是导致患者死亡的首位原因。近年来发现循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是导致患者发生复发转移的重要原因。因此检测CTCs并探讨其意义已成为当前临床研究的热点。外周血循环肿瘤细胞(CTCs)是指自发或诊疗操作手段由肿瘤原病灶或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。Cellsearch系统是目前用于乳腺癌的自动化程度最高的CTCs检测技术,它的原理是采用上皮细胞粘附分子(EpCAM)免疫磁珠富集技术联合CK19单标法免疫荧光技术,对外周血中数目较少的循环肿瘤细胞浓缩。它有较高的特异性、敏感性,受研究人员人为因素影响小。但是乳腺癌细胞常常会发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),常常导致检测结果假阴性。上皮细胞-间充质转化(EMT),是指上皮细胞失去了细胞极性、基底膜的连接等上皮表型,获得更强的迁移和侵袭能力,同时肿瘤细胞可能不再表达EpCAM/CK。因此基于上皮细胞标志如EpCAM和CK的存在Cellsearch系统不可避免的假阴性。人乳腺珠蛋白(human mammaglobin,hMAM)是上皮组织来源的组织特异性标志物,它们表达异常与乳腺癌的微转移密切相关。量子点是一种新型荧光探针,它的荧光强度比常用的有机荧光染料高、稳定性强,它的发射峰窄而对称,且连续分布,重叠小。本文探讨改良细胞角蛋白CK19单标法,应用CK19联合人乳腺珠蛋白—量子点(human mammaglobin-quantum dot,hMAM-QDs)双标法检测乳腺癌外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs),并分析比较两者的临床检测效果。方法:1.制备EpCAM免疫脂质磁球,对EpCAM免疫脂质磁球进行粒径分析以及饱和磁化强度测定。2.分别用乳腺癌单标法和双标法测定五组梯度乳腺癌231细胞捕获效率。3.分别从15例患者中采集15 ml血液,一式两份,分别用单标法和双标法两种方法检测血样中CTCs。4.荧光显微镜观察两种方法EpCAM免疫磁球分离乳腺癌临床血样结果。5.单标法和双标法检测乳腺癌循环肿瘤细胞与临床病理特征关系。结果:1.经检测,测得固含量值为(2.6±0.15)mg/ml。EpCAM免疫脂质磁球平均粒径为300±50nm,符合要求。(图1 a)。Fe3O4磁流体的最大比饱和磁化强度为42.4 Am2/Kg,而EpCAM免疫磁性脂质体的最大比饱和磁化强度为18.7 Am2/Kg。因此,脂质体对于Fe304磁流体的包覆从一定程度上降低了磁性能。2.通过五组梯度捕获效率试验表明磁球的性能非常佳,两种染色法对乳腺癌231细胞系的分离能力均高于85%,同时CK19联合hMAM-PL(QDs)双标法检测结果略好于CK19单标法染色,说明双标法对于临床检验将会有灵敏度高,识别率强等显著特点。3.结果显示:单标法共检测得到11个CTCs,双标法共检测得到19个CTCs。大多数标本应用双标法检测得到的CTCs多于或者等于单标法检测结果,NO.9号患者双标法检测结果少于单标法检测结果,结合捕获效率试验结果分析,这可能与单标法检测的假阳性有关。4.荧光显微镜观察效果。5.CK19单标法检测CTCs阳性与乳腺癌组是否绝经、TNM stage、淋巴结转移、远处转移有关。而hMAM和CK19双标法检测CTCs阳性与乳腺癌组的年龄、是否绝经、分化程度、淋巴结转移、病理分化、HR、ER、HER均无关(P>0.05);而与远处转移、血清CEA及TNM stage密切相关,差异具有统计学意义。结论:CTCs是乳腺癌远处转移病灶形成的重要前提和基础,尽早检测CTCs对指导临床准确判断患者预后和病情具有重要意义。CK19联合hMAM-PL(QDs)双标法可作为诊断乳腺癌患者循环肿瘤细胞的生物标志物,其检测效果好于传统CK19单标法。未来的研究还需要通过大量研究观察,探索更加高效敏感的新方法并且进一步阐述CTCs与乳腺癌患者预后的关系及CTCs在乳腺癌综合治疗中的应用价值。第二章 密度梯度离心联合EpCAM免疫磁珠法检测上皮性卵巢癌循环肿瘤细胞及其与肿瘤复发转移的相关性研究背景和目的:卵巢癌是中国发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一,其主要死因是肿瘤细胞的远处转移和治疗后复发。很多卵巢癌患者接受肿瘤和淋巴结切除,之后又接受化疗和放疗,按时定期复查,肿瘤标志物及影像学都未及时发现癌症转移,最后突然发现复发和远处转移。因此,早期有效的预测肿瘤复发有很大意义。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。已有实验证明循环肿瘤细胞有助于卵巢癌患者的早期诊断和预后的判断。目前对卵巢癌CTCs方面研究较少,且效果不佳。本实验尝试应用密度梯度离心联合上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecular,EpCAM)免疫磁珠富集法对卵巢癌患者进行CTCs检测,了解不同卵巢癌患者的临床特征与CTCs阳性率的相关性,以期探讨卵巢癌转移和复发与CTCs的相关性。2方法:50例上皮性卵巢癌患者外周血标本。治疗方法为手术加化疗。采血前24小时禁高脂高糖饮食。抽血时患者处于安静状态,空腹,取坐位。一般从肘正中静脉取全血样本7.5mL。将收集的外周血转移至10 ml管中,应用密度梯度离心联合免疫磁珠富集法处理标本。使用SPSS17.0统计软件,统计分析CTCs与卵巢癌临床病理特征的关系。3.结果在荧光显微镜下DAPI(+)、CK19(+)、CD45(一)同时细胞核DAPI(+)(蓝色)与相应细胞浆抗原CK19(+)(绿色)染色部位基本重合的细胞定义为CTCs。CTCs检测结果表明:对照组外周血中未检出循环肿瘤细胞,卵巢癌组患者外周血中检出循环肿瘤细胞64%(32/50),两组阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。本实验中观察了 50例卵巢癌患者,研究发现CTCs阳性与卵巢癌患者的年龄(≥40岁组和<40岁组)、肿瘤部位(左侧和右侧)、分化程度(低分化组和中高分化组)、淋巴结转移组和TNM分期无关,而在远处转移组中和复发组中的差异有统计学意义。4.结论:CTCs与肿瘤的转移和预后密切相关。高水平的CTCs数量提示上皮性卵巢癌患者有远处转移和复发的风险更高。第三章 循环肿瘤细胞对卵巢癌的预后价值的荟萃分析研究背景和目的:卵巢癌是死亡率最高的妇科肿瘤。发病原因不明,早期患者的临床症状不明显,扩散速度快,治疗效果不佳,而且近年来卵巢癌的发病率呈年轻化的趋势,目前缺乏有效的早期筛查和及时评价患者预后的方法,因此卵巢癌死亡率居于妇科肿瘤之首。现在常用的卵巢癌早期诊断和判断预后的方法是影像学和CA125检测,CA125在过去的临床筛查和治疗效果观察中发挥了很大的作用。但是在早期卵巢癌患者血液中经常呈阴性,而且CA125不是卵巢癌的特异性标志物,在其他恶性肿瘤如输卵管腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌患者中CA125的水平也会升高。因此寻找新的高效特异的观察指标有重要意义。近年来,新兴的循环肿瘤细胞检测技术,已成为研究热点并进入逐渐临床应用。外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是指自发或诊疗操作手段由肿瘤原病灶或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。转移到骨髓中的循环肿瘤细胞称为(disseminated tumor cells DTCs)。检测这些肿瘤细胞相当于“体液活检”,为患者提高更多有用信息。但是CTCs在血液中极其微量,大约每10亿个正常血细胞中才会发现1个循环肿瘤细胞,因此需要极其敏感的CTCs收集鉴定检测手段。但是目前仍然没有统一的卵巢癌循环肿瘤细胞检测标准和方案。这些技术虽然都具有自己的优点,但试剂成分,检测条件均没有实现标准化,同时操作者的个人主观性也会影响实验结果,因此实验得出的结果也有很大争议。本文系统检索了三大数据库关于循环肿瘤细胞与卵巢癌预后的相关文献,有的文献表明外周血循环肿瘤细胞(CTCs)和骨髓中循环肿瘤细胞(DTCs)与卵巢癌的不良预后有关,也有文献报道CTCs/DTCs与卵巢癌的预后无关。本研究通过检索三大数据库研究纳入文献的患者CTCs/DTCs水平与生存资料(总生存期、无病生存期)之间的相关性。方法:在Web of Science,PubMed及Embase数据库中以“循环肿瘤细胞、卵巢癌、诊断”等为关键词检索CTCs/DTCs与卵巢癌预后的文章,检索时间为建库到2015年10月的相关文献。以纽卡斯尔渥太华量(Newcastle-Ottawa Scale,NOS)评价纳入文献质量。本文采用stata 12.0软件进行meta分析。不同研究之间的异质性检验采用Q检验和12统计量来分析。当P>0.1,12<50%时,组内各研究间无统计学异质性,采用固定效应模型;反之则认为组间各研究结果异质性较高,选择随机效应模型。用OR或HR(95%CI)权重分析来合并估计的风险,并用森林图显示计算结果。当Z检验中P<0.05时,认为合并的OR或HR具有统计学显著性。按研究方法分组进行亚组分析,评价研究异质性来源;为观察合并效应值的稳定程度,将研究逐一排除进行敏感性分析。发表偏倚采用Egger’s检验和Begg’s检验来分析。结果:本文共纳入15篇文献。通过对患者临床特征与卵巢癌CTCs/DTCs的关系研究表明:卵巢癌CTCs/DTCs与CA125、肿瘤类型、是否有腹水及铂类化疗药物的是否敏感等临床特征有关,CA125高表达的患者其CTCs/DTCs的检出率要高于CA125低表达的患者。浆液性卵巢癌患者其CTCs/DTCs的检出率要高于非浆液性卵巢癌患者。有腹水的患者其CTCs/DTCs的检出率要高于没有腹水的患者。铂类化疗药物的是否敏感也与CTCs/DTCs有关联,铂类化疗药物抵抗的患者CTCs/DTCs的检出率要高于对铂类化疗药物的敏感的患者。而患者的临床分期,淋巴结转移情况,肿瘤大小,剩余病灶及种族等因素则与CTCs/DTCs无关。这一结论需要未来更多文献进一步验证。荟萃分析表明:卵巢癌CTCs/DTCs阴性的患者整体生存率(OS)(HR=1.84;95%CI[1.53-2.21])和无进展生存期(PFS)(HR=1.67,95%CI[1.41-1.98])均明显长于CTCs/DTCs 阳性的患者。OS与CTCs/DTCs关系的亚组分析中显示:DTCs和CTCs均能增加卵巢癌患者的死亡风险,均能评估卵巢癌的预后价值。RT-PCR以及other ICC两种检测方法对卵巢癌患者中的CTCs/DTCs检测有意义。手术以及化疗+手术这两种治疗方式的卵巢癌患者中死亡风险高。同时本文总结了 OS的影响因素,分析得出卵巢癌OS与患者剩余病灶和有无腹水有关,与FIGO无关。这可能是由于文献数量较少,需要进一步证实。PFS/DFS与CTCs/DTCs关系的亚组分析中显示:DTCs和CTCs均能增加卵巢癌患者的疾病进展,均能评估卵巢癌的预后价值。RT-PCR和other ICC检测卵巢癌患者中的CTCs/DTCs有统计学意义。手术与化疗+手术两种治疗方式的卵巢癌患者疾病进展快。同时本文总结了 PFS/DFS的影响因素。Ascites、FIGO、Residual disease均与卵巢癌PFS/DFS有关联。本文结果显示CTCs/DTCs均与卵巢癌预后明确相关。本文的漏斗图和敏感性分析表明纳入文献质量好,无明显偏倚。可见循环肿瘤细胞检测将有可能成为指导临床评估卵巢癌患者预后生存的的新工具。结论:本研究显示,CTCs/DTCs阴性患者的整体生存期(OS)及无进展生存期(DFS)比CTCs/DTCs阳性患者的OS/DFS长,结果有统计学意义。本文的漏斗图和敏感性分析表明纳入文献质量好,无明显偏倚。但目前卵巢癌循环肿瘤细胞文献较少,循环肿瘤细胞检测技术没有统一标准,需要进一步完善。CTCs/DTCs检测可能会成为早期卵巢癌诊断发现及转移性卵巢癌预后评估的有效方法。