利用PCR-DGGE法对樟子松有机凋落物层真菌多样性及高频菌株酶活研究

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本研究利用传统的分离鉴定方法与具有可靠性强、重现性高等优点的PCR-DGGE技术相结合,对帽儿山地区人工樟子松林凋落物有机层分解真菌菌群的多样性进行了研究。同时,通过发酵纯培养方法对高频出现的三株丝状真菌分泌的木质纤维素酶活性进行了深入研究。通过传统分离手段共获得21个樟子松凋落物分解真菌种类,大多数为半知菌类,其中包括5种未知菌。另外,在利用PCR-DGGE手段研究凋落物真菌多样性中,首先利用Bead-Beating法直接对凋落物L层、F1层、F2层和H层分别提取总基因组,然后以nu-0817-5’与nu-1536-3’、nu-0817-5’与nu-1196-3’-GC两对引物进行巢式PCR,特异性地扩增18S rDNA序列中的V4-V8区域,最后将所得到约460bp的扩增产物通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行分析,结果获得清晰且可重复的条带。DGGE测序结果分别为Aureobasidium pullulans、Ascomycota sp.、Sporobolomyces inositophilus、Desmazierella acicola、Pulchromyces fimicola、Uncultured Hypocreales、Geopyxis majalis。通过相似性分析表明,随着分解程度的加深,H层与其他分解层的真菌菌群图谱的相似性逐渐降低,但L层、F1层和F2层之间相比,真菌群落结构没有发生显著变化。综合来看,真菌菌株Sporobolomyces inositophilus均被PCR-DGGE和传统分离两种技术检测到,除此以外,两种方法分别检测到的其他真菌种类都未有重叠和相似。选取在樟子松凋落物L层和F层高频出现的三株丝状真菌:Alternaria sp., Penicillium sp和Pestalotiopsis sp作为研究对象,以樟子松新鲜落叶为作用底物。通过发酵纯培养的方法,测定底物质量损失及发酵过程中产生的羧甲基纤维素酶(EC3.2.1.4)、滤纸酶(EC3.2.1.91)、漆酶(EC1.10.3.2)和锰过氧化物酶(EC1.11.1.13)的酶活性动力学曲线。经研究测定,Alternaria sp.引起底物总有机物质质量损失最大;Penicillium sp.产生的锰过氧化物酶活性最高。三株丝状真菌同属于真菌功能群中的木质纤维素分解者。
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