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一、概述脑胶质瘤是最常见的颅内原发肿瘤,生长迅速,目前治疗大多为常规手术切除并加以放疗、化疗以及免疫治疗,但由于肿瘤细胞具有侵袭能力的特征,恶性肿瘤向周围“正常脑组织”浸润性生长,导致手术难以完全切除,术后复发率高,不能改善大多数病人的预后,一般存活时间少于诊断后18个月,因此探索有效治疗方法成为神经外科学的难题。随着肿瘤分子生物学的发展,研究已证实,端粒与端粒酶是细胞分裂和增殖的基础,端粒是真核细胞染色体末端由重复DNA序列和蛋白质组成的复合物,正常情况下随每一轮的细胞分裂而缩短,当端粒缩短到一个临界长度时,细胞停止分裂而衰老死亡。故端粒长度是决定细胞增殖能力和寿命的分子标志。端粒酶是一种由hTERT、hTR和hTPI组成的特殊逆转录酶,能以自身的hTR为模板,通过逆转录方式催化端粒重复序列(TTAGGG)复制防止端粒的缩短,维持细胞的增殖活性,阻滞因端粒缩短诱发的细胞衰老凋亡。端粒酶异常再活化是恶性胶质瘤细胞无限增殖和凋亡抑制的根本原因,因此作为目前已知的最广泛、特异性最高的肿瘤标记物,其活性与颅内恶性肿瘤发生、发展及预后密切相关,抑制端粒酶的活性就可有效的抑制恶性肿瘤的发生和发展。以端粒酶为靶点,应用端粒酶抑制剂协同常规方法治疗脑肿瘤已成为一种新策略。目前有多种方法可抑制端粒酶,其中以反义核酸技术尤为突出,成为当前肿瘤多基因治疗的研究热点,通过反义技术设计制备的反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides,ASODN)是一类经人工合成或构建的反义表达载体表达的寡核苷酸片段,其特有的核苷酸序列决定了它能与靶DNA或靶RNA的碱基互补,多途径封闭靶基因的表达。已有大量研究表明,ASODN在体外和瘤内的注药有明显的抑制脑胶质瘤细胞恶性增生,促其调亡作用,并能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,对于治疗脑胶质瘤具有潜在的活力。但由于ASODN为多聚阴离子,而细胞膜上带一定的负电荷不易透过细胞膜、且在转运过程中还易被核酸内切酶迅速降解。因此需要一种载体来协助运载。纳米粒(nanoparticles NP)作为新型给药体系,一般指粒径在1~1000nm的粒子,是一类高分子物质材料,药物可以溶解、吸附或包裹于材料中,具有尺寸效应、表面效应、易吸收等生物优势。当前纳米技术在靶向给药和医用高分子材料研究领域的应用日益广泛,通过这种技术,国内外已有多种方法将ASODN吸附镶嵌在NP表面来增加其对肿瘤细胞的转染和稳定性,但体内给药后,效果并不理想。为此需要寻求一种有效纳米载药材料来包裹,协助运载保护ASODN。二、研究目的本研究优选可降解的高分子材料a-氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylateBCA)为制备NP的载体,采用界面聚合法,ASODN为模药,通过优化工艺,包裹制备载药纳米粒(ASODN in NP),并制成冻干品后,考察其稳定性,将其转染C6脑胶质瘤细胞,观察其对细胞抑制的影响。三、主要研究方法、内容和结论第一部分ASODN in NP制备工艺的优化:本实验以可降解的高分子材料B C A为制备NP的载体,ASODN为模药,采用界面聚合法,以NP的粒径和粒径分布为主要控制指标,通过相关文献和预实验确定单因素。根据单因素试验结果,优选ASODN浓度、pH值及Tween-80量3个主要因素,每个因素选择3个水平,按正交试验设计原理用正交设计表L9(34)安排试验,以粒径、载药量、包封率为考察指标,优化NP的制备工艺,筛选处方,确定最优制备条件:ASODN浓度为5.0×10-6mol/L、pH值为8.0及7wween-80用量为1.25g。。第二部分:ASODN in NP性质的研究、纯化及冻干工艺的考察。按照最优条件所制备3批NP混悬液为均匀半透明状分散系,体系略带乳光,包封率(EE)、载药量(DL)分别为96.67+1.45%,10.1±0。35%;取NP混悬液适当稀释后,用激光粒度分析仪测定三批样本的平均粒径为94.9±6.2 nm,多分散度为0.05±0.012,说明粒径分布均匀,透射电镜下观察,见粒子形状规则,大小均匀,无粘连;对载药纳米制剂的纯化工艺进行了考察,试验结果表明:采用超速冷冻离心法,在4℃时以20000rpm的转速离心30min,洗涤离心三次能达到很好的纯化效果;对ASODN in NP冻干工艺考察结果表明:以5%乳糖为冻干保护剂,冷冻干燥样品可以得到光滑圆整的ASODN in NP冻干品。第三部分:ASODN in NP稳定性性研究。采用加速试验,在温度(40±2)℃,湿度(75±5)%的条件下考察了三批ASODN in NP冻干品的稳定性,一共考察3个月,分别于0、1、2、3月取样。检测项目包括性状、鉴别、检查,具体考察项目为外观色泽、PH值、粒径、包封率、载药量、再分散性、再分散后的澄明度等。作为对照,在室温下考察ASODN in NP混悬溶液的稳定性三个月,考察项目同上。结果:在加速试验考察期内,ASODN in NP冻干品的外观色泽变化不大,pH在规定范围内,粒径、包封率、载药量均无明显改变,再分散性良好,澄明度合乎要求。三批ASODNin NP混悬液在室温稳定性试验考察期内,可见粒径逐渐增大,包封率和载药量逐渐减小,混悬液颜色逐渐变混变深,并有絮凝现象出现。说明随着时间的推移,ASODN in NP混悬液不稳定。说明将ASODN in NP混悬液冷冻干燥后,可大大提高其稳定性。按照最优制备工艺方法制备ASODN 1n NP,同时将传统的ASODN吸附在NP表面(ASODN-NP)和游离ASODN(FREE ASODN)作为对照。上述溶液与小牛血清混合,置于恒温水浴箱中37℃水浴;灭活血清酶后;加入4mmol/L的NaOH溶液适量。然后采用含7 M尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行电泳分析,用EBS进行染色,将凝胶置于紫外光下,显影照相。实验结果:ASODNin NP样品有明显的亮条带,亮条带为游离的ASODN,FREE ASODN则没有亮条带,ASODN-NP样品,亮度不及ASODN in NP样品,说明FREE ASODN已完全降解,ASODN被包裹制备的NP能够有效的保护ASODN不被血清中的核酸酶降解,这种保护作用明显优于传统的通过离子相互作用将ASODN吸附在聚合物表面制备的NP。第四部分:ASODN in NP对C6胶质瘤细胞的抑制作用。本实验分5个组:A组.仅加入培养液的空白对照组;B组.未加ASODN的空白NP组(BCA-NP);C组.游离ASODN组(FREEASODN);D组.传统吸附制备的NP组(ASODN-NP);E组.本实验制备的包裹ASODND的NP组(ASODNinNP)。1.流式细胞术检测细胞周期:取对数生长期的C6细胞于24孔板中传代培养24h后,加入上述各实验组转染48h后,制成流式细胞检测样品后,上流式细胞仪进行细胞周期分析。流式细胞仪检测结果发现,转染后与对照组相比,除BCA-NP外,其他各组细胞周期均发生显著变化,其中ASODN in NP组差异非常显著(P<0.01),表现合成前期(Go/G1)期细胞比例显著增高,DNA合成期(S期)细胞比例减少;与传统的吸附法制备的NP相比,ASODN inNP组也表现出显著性差异(p<0.01),G2/M期细胞数目无显著变化,说明ASODN in NP可有效阻滞C6胶质瘤细胞于G1期向S期,抑制细胞增殖,促进了细胞凋亡。2.CCK-8试剂盒测定细胞相对生长率。取传代后处于对数生长期C6细胞,经胰酶消化,低速离心收集,在细胞计数板上记数,调整细胞密度至5×107/L,接种于96孔培养板,置含CO2孵箱中培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况;更换培养液,再培养24 h后,将实验各组不同浓度的稀释液(ASODN终浓度分别为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0μmol)加入各孔细胞上开始转染,以未转染空白组做为对照。ASODN in NP组与ASODN-NP组加入与ASODN组等量的ASODN,空白对照组只加培养液。培养24h后向每孔加入CCK-8液10μl继续培养4 h,吸弃上层液体,在酶标仪上测定各样品组各孔的450 nm处的吸光度值(A值),按以下公式计算细胞相对生长率(RGR%)。RGR%=实验组A值/对照组A值×100%。对C6胶质瘤细胞的生长抑制实验结果表明,通过BCA包裹制备的ASODNin NP,在ASOND相对终浓度5-10μmol/L时,良好的C6细胞生长情况就开始受到抑制,增殖减慢,凋亡增多,其效应优于FREE ASODN和ASODN-NP组,在ASODN相对终浓度10-15μmol/L时表现出较强的抑制效应,且随浓度的增加增殖活力进一步降低,对C6细胞增殖率的剂量依赖性降低趋势显著优于其他各组,可使ASODN能更有效的发挥对胶质瘤细胞的抑制效应。