透明质酸(HA,Mr=105~106)作为一种直链线性高分子黏性多糖,是动物组织细胞间质的主要成分。由于其独特的性质而被广泛应用于医药、临床诊治、化妆品和食品保健行业。近年来研究发现不同相对分子质量的HA具有不同的生物活性,透明质酸寡糖(o-HAs,Mr=10 k以内)具有免疫活性、促进血管内皮细胞增殖和逆转肿瘤细胞多药耐药性等作用。目前常用的o-HAs是牛睾丸型透明质酸酶(BTH)水解HA中β-1,4糖苷键生成以氨基葡萄糖为还原性末端的寡糖系列,然而BTH来源有限、水解不专一且水解产物复杂,使寡糖制备效率很低。水蛭型透明质酸酶(LHase)能够水解HA中β-1,3糖苷键生成还原性末端为葡萄糖醛酸的饱和寡糖系列,具有水解效率高和水解高度专一的特点,然而当前对于LHase和LHase产生的o-HAs的研究报道甚少。本研究采用LHase水解HA,对水解进程进行分析,对主要产物进行分离和纯化,并对其免疫活性、促血管生成和抑制肿瘤细胞耐药性的生物功能进行研究。本研究首先对LHase水解产生的寡糖的HPLC分析方法进行优化,通过流动相种类、浓度和流速的优化得到,采用流动相0.1 mol/L NH4H2PO4溶液对YMC-Pack Polyamine II色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)等度洗脱,在流速0.5 mL/min,紫外210 nm检测和柱温30℃的条件下,透明质酸四糖(HA4)和六糖(HA6)能够被快速地定性和定量分析,且该方法具有很好的灵敏度、精密度、回收率和稳定性。为了分析LHase水解产物特征,本研究首先考察了LHase的稳定性,研究结果表明,LHase在38℃,水溶液具有高酶活,且稳定性高。采用ESI-MS和HPLC法对该条件下不同酶活和反应时间的中间产物进行分析,结果表明,LHase水解HA的主要产物是四糖和六糖,最小产物是二糖。在10 g/L HA溶液中,酶活1.6×104 U/mL反应24 h,1 g HA能够制备0.42 g HA4和0.46 g HA6。此外,酶活越高,产物中四糖的比例也越高。本研究采用不同类型的离子交换树脂(640,DEAE,D730,D750,Q FF,Dowex 1×2)对HA4和HA6进行试分离,结果显示,只有Q FF离子交换剂能够高效地吸附和解析寡糖,静态吸附率和解析率可达75%以上。进一步对洗脱条件参数(平衡pH、静态洗脱浓度、洗脱体积和流速)进行优化,用紫外和ESI-MS对分离效果进行分析,结果显示,用pH 8.0 Tris-HCl(0.05 mol/L)平衡Q FF色谱柱,上样清洗后,采用0.2 mol/L NaCl溶液对色谱柱进行8倍柱体积线性梯度洗脱,HA4和HA6得到完全分离,不含核酸、蛋白等杂质,用Sephadex G-10脱盐后,四糖和六糖的纯度可达90%。此外,本研究对HA4和HA6的生物功能进行了研究。采用MTT法研究了HA4和HA6对小鼠免疫脾细胞的增殖效果,研究表明,与相对分子质量较高的寡糖(平均Mr=4k)相比,HA4和HA6能够高效的促进脾细胞增殖,尤其当HA4和HA6(320μg/m L)与ConA因子共同作用时,脾细胞的增殖率分别可达64.4%和68.2%;采用小鼠Matrigel胶塞模型对HA4和HA6的促血管生成效果进行研究,结果表明,HA4和HA6具有显著的促血管生成作用。与空白对照组对比,在50μg/只时,HA4和HA6实验组的微血管相对面积(RVA)分别增加53.5倍和49.1倍,而2 mg/只的o-HAs(平均Mr=4 k)对照组的RVA只增加9.91倍;采用MTT法分析了HA4和HA6对MCF-7/ADM细胞对ADR耐药性的逆转作用,结果表明HA4和HA6对MCF-7/ADM细胞具有一定的耐药逆转性,而相对分子质量较高的寡糖几乎无逆转作用。此外,本研究还参照了BTH水解产生的相应寡糖,研究表明,不同酶产生的HA4和HA6在相同剂量下,对免疫增殖、促血管生成作用和逆转肿瘤细胞耐药性均无显著性效果差异。