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从龙眼果肉中分离纯化获得两个组分多糖LPG1和LPG2;采用凝胶色谱激光光散射(GPC-LLS)、红外光谱(IR)、核磁共振(NMR)等方法对多糖的结构进行了表征;采用转录组测序,结合受体和相关通路抑制剂与通路蛋白表达(Western blot,WB)分析了龙眼多糖激活巨噬细胞的分子作用机制;采用纤维素酶降解LPG1和LPG2,初步分析了 1,4-β-葡聚糖的酶切降解对LPG1和LPG2激活巨噬细胞活性作用的影响,主要结果如下:1.龙眼多糖的结构表征采用GPC-LLS、IR、离子色谱、NMR等手段对纯化获得的两个多糖组分的结构进行了表征。结果显示,龙眼多糖LPG1是由岩藻糖,半乳糖,阿拉伯糖,甘露糖,葡萄糖,半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸以摩尔比0.86%:18.64%:16.43%:25.62%:35.42%:2.44%:0.59%构成,数均分子量Mn为1.148×105,重均分子量Mw为2.386×105,旋转半径Rz为47.5 nm的α构型近球状多糖。LPG2是由岩藻糖,半乳糖,阿拉伯糖,甘露糖,葡萄糖,半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸以摩尔比 4.54%:28.63%:17.31%:12.83%:32.52%:1.73%:2.45%构成,数均分子量Mn为1.574×104,重均分子量Mw为7.008×104,旋转半径Rz为6.3 nm的β构型近六面体状多糖。2.龙眼多糖激活巨噬细胞的活性作用结果显示,在2.5～100 μg/mL浓度范围内,LPG1和LPG2具有促进巨噬细胞增殖和增强其吞噬能力的作用,在2.5 μg/mL时,巨噬细胞的吞噬率分别为对照组的 148.94±4.23%(p<0.05)和 156.10±1.04%(p<0.05)。在 25 μg/mL 时,巨噬细胞的吞噬率分别为对照组的1 12.62±0.65%(p<0.05)和135.14±4.10%(p<0.05)。同时,LPG1和LPG2显著增加巨噬细胞的NO、TNF-α和IL-1β的分泌。在100 μg/mL时,LPG1组的巨噬细胞NO、TNF-α和IL-1β的分泌量分别为对照组的 115.33 ± 1.74%(p<0.05),8139.56±150.90%(7988.98 pg/mL,p<0.05)和 368.19± 142.80%(66.79 pg/mL,p<0.05)。LPG2组的巨噬细胞 NO、TNF-α、IL-1β分泌量分别为对照组的 125.71±2.18%(p<0.05),701.45±19.90%(992.13 pg/mL,p<0.05)和 231.46± 22.36%(47.38 pg/mL,p<0.05)。3.龙眼多糖激活巨噬细胞的转录组分析采用全基因组表达分析,结合KEGG通路及GO功能注释对龙眼多糖激活巨噬细胞差异表达基因分析。结果显示,LPG2组表达显著上调的基因84个,表达显著下调的基因201个,主要富集在Toll样受体、NOD样受体、NF kappa B、TNF、JAK、MAPK等免疫相关信号通路。通过将差异基因比对到KEGG通路发现,LPG2 主要通过上调 TLR4→MyD88→IRAK 1→TRAF6→TAK1→IKKβ→p105→MEK1/2→ERK→AP-1→IL-1β信号通路中 MyD88、TAB2、IKKβ、p150、Tpl2、MEK1/2、AP-1 基因的表达,上调 TLR4→TRAM→RIP1→TAB→IKKβ→IkBα→p50→TNF-α信号通路中各基因的表达,上调NOD2→RIP2→TAB2→JNK→AP-1→IL-1β信号通路中 NOD2、RIP2、TAB、JNK、AP-1基因的表达。同时,通过上调JAK→STAT→IRF9→SLIM→Bcl-2信号通路中JAK、STAT、IRF9基因的表达,上调JAK→GRB→SOS→Ras→Raf信号通路中 JAK、GRB、SOS、Ras、Raf基因的表达,上调 JAK→PI3K→AKT→mTOR信 号通路中 JAK、PI3K、AKT、mTOR 基因的表达。上调RTK→GRB2→SOS→Ras→RafB→MEK2→ERK→MNK1/2→CREB 信号通路中GRB2、SOS、Ras、RafB、MEK2、MNK1/2、CREB 基因的表达。通过上调TNFR→TRADD→TRAF2/5→TAB 1/2/3→MKK4/7→JNK1/2→AP-1→IL-1β信号通路中 TRAF2/5、TAB1/2/3、MKK4/7、JNK1/2、AP-1 基因,上调TNFR→TRADD→TRAF2/5→NIK→IKKα→IκBα→NF-κB信号通路中 TRAF2/5、NIK、IKKα、IκBα、NF-κB 基因。通过下调 NOD2→RIP2→TRAF3→IKKe→IRF3/7→IFNα/β信号通路中TRAF3、IRF3/7基因的表达,下调TNFR→TRADD→TRAF2/5→TAB1/2/3→MKK3/6→p38→c/EBPβ信号通路中的TRADD、MKK3/6、p38、c/EBPβ基因。筛选获得的13个免疫调控相关基因(Cd40,Cpeb4,Cxcl10,Cxcl11,Cxcl2,Hmmr,Ifih1,Irg1,Isg15,Isg20,Mapk9,Mat2b,Zfp62)中,其中Toll样受体通路相关基因5个(Cd40,Spp1,Mapk9,Cxcl11,Cxcl10);NOD样受体通路相关基因2个(Cxcl2,Mapk9)。综合差异表达基因与通路富集分析表明,LPG2主要通过调节Toll样受体和NOD样受体相关信号通路介导巨噬细胞的激活。4.纤维素酶解改性对龙眼多糖激活巨噬细胞活性的影响采用纤维素酶酶解龙眼多糖,对比分析了 LPG1和LPG2酶解前后激活巨噬细胞的活性与相关通路表达的变化。结果显示,与原多糖相比,纤维素酶解获得的两个多糖在25～100μg/mL范围内,具有更显著(p<0.05)的激活巨噬细胞的活性作用。在100 μg/mL时,酶解LPG1和LPG2组的相对吞噬率为67.74±0.037%和 76.04 士 0.042%,分别升高至原多糖组的 129.79%(p<0.01)和 130.03%(p<0.01)。在 100 μg/mL 时,酶解 LPG1 和 LPG2 组 NO、TNF-α、IL-1β分泌量分别为 104.74±2.71%,116.51±1.16%;13281.27 pg/mL,11156 pg/mL 和 148.57 pg/mL,160.19 pg/mL,均显著(p<0.05)高于原多糖组。采用TLR4和NOD2受体通路抑制剂预孵育,抑制剂组(多糖+受体抑制剂组)可以显著抑制多糖诱导的巨噬细胞吞噬和细胞因子分泌。结果显示,与LPG1、LPG2、酶解LPG1和酶解LPG2比较,TLR4抑制剂TAK-242和IRAK-4处理后,多糖诱导的巨噬细胞TNF-α和IL-1β分泌分别降低为非抑制剂组的30.86～81.26%(p<0.05),38.31～69.19%(p<0.05)和 22.83～94.16%,76.00～92.04%(p<0.05)。NOD2抑制剂GSK583处理后,多糖诱导的巨噬细胞TNF-α和IL-1β分泌分别降低为非抑制剂组的34.95～69.28%(p<0.05)和36.18～119.50%。结合细胞免疫荧光的结果表明,龙眼多糖与其酶解多糖主要通过TLR4和NOD2受体介导的信号通路激活巨噬细胞。同时,相关免疫通路蛋白表达分析的结果显示,酶解LPG2组处理诱导TLR4和NOD2下游通路的STAT,NF-κB,p38MAPK的磷酸化水平分别为原多糖组的1.18,1.28和1.53倍。综合上述结果表明,酶解多糖通过上调TLR4和NOD2通路中STAT,NF-κB,p38MAPK的磷酸化水平,表现出显著的激活巨噬细胞的活性作用。