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目的:Cre/loxP重组系统是应用最广阔,研究最多的特异性重组系统,为了消除由非目的基因对转基因细胞和动物带来的影响,更好的研究转入基因的单一功能,本实验利用Cre/loxP特异性重组系统构建可删除标记基因载体,构建的载体是以可以产生特异性红色荧光的商业化载体DsRed2-1为骨架,加入了LoxP序列,并加入了MCS序列,有利于目的基因的插入,同时也克隆了CMV启动子,合成了TK-IRES序列,为生产较为安全的转基因动物奠定了基础,为他人利用这些基因序列构建不同用途的载体,满足不同的实验需要奠定了基础。 方法:(1)克隆CMV启动子,人工合成了LoxP-MCS-LoxP序列,先后连接到DsRed2-1载体上构建真核表达载体上,命名为pCMV-Red-LoxP,人工合成Cre重组酶序列,连接到pTRE-tight载体上,然后将tight-Cre片段连接到pCMV-Red-LoxP载体上,构建成疑似的pCMV-Tt-Cre-LoxP-Dsred载体。 (2)人工合成TK基因序列,连接到pCMV-Red-LoxP载体上,命名为pCMV-Red-LoxP-TK,用该载体转染新疆细毛羊成纤维细胞,观察结果。 (3)利用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切pDsRed-CMV-LoxP-TK载体,将酶切片段连接到pEGFP-C1载体上,命名为pEGFP-C1-LoxP-CMV-TK,用构建好的该载体和酶切的载体片段分别转染细毛羊成纤维细胞,观察现象。 (4)人工合成TK-IRES序列和一段特殊序列,将合成的序列分别连接到构建好的真核表达载体pCMV-Red-LoxP上,命名为pCMV-LoxP-TK-IRES-Red2,将构建好的载体电穿孔法转染细毛羊成纤维细胞。 (5)将人工合成的Cre重组酶序列连接到pIRES2-EGFP载体上,命名为pIRES2-EGFP-Cre,将构建好的载体转染细胞,提取总RNA,RT-PCR法检测,用分子水平上使用的Cre重组酶对酶切的pCMV-LoxP-TK-IRES-Red2载体进行重组反应,将pCMV-LoxP-TK-IRES-Red2载体用SmaI酶切后转染C2C12细胞,G418筛选阳性克隆,用pIRES2-EGFP-Cre载体转染阳性克隆细胞,观察统计分析,用诱导丙氧鸟苷(GCV)阳性克隆细胞,统计分析。 结果:(1)成功克隆了CMV启动子,构建的疑似pCMV-Tt-Cre-LoxP-Dsred载体经鉴定两个LoxP序列间的酶切位点消失,两个LoxP序列之间酶切位点被删除。 (2)成功合成了TK基因序列,将构建成功的pDsRed-CMV-LoxP-TK载体转染细毛羊成纤维细胞,未产生特异性红色荧光,pDsRed-CMV-LoxP质粒转染细胞产生了特异性红色荧光。 (3)成功构建了pEGFP-C1-CMV-LoxP-TK,将该重组载体和酶切的重组载体同时转染成纤维细胞,未酶切的重组载体产生了特异性绿色荧光,酶切的重组载体未产生特异性绿色荧光。 (4)成功构建了pCMV-LoxP-TK-IRES-Red2载体,送公司测序结果完全正确,酶切重组载体电穿孔法转染成纤维细胞,产生了特异性红色荧光。 (5)成功构建了pIRES2-EGFP-Cre真核表达载体,表达了Cre重组酶,分子水平上使用的Cre重组酶使pCMV-LoxP-TK-IRES-Red2载体发生了重组,将pCMV-LoxP-TK-IRES-Red2载体酶切后转染C2C12细胞,G418筛选到了带红色荧光的阳性克隆细胞,用pIRES2-EGFP-Cre载体转染阳性克隆细胞,荧光细胞比率降低了24.3％,丙氧鸟苷对阳性克隆细胞有杀伤作用,对转染的细胞有杀伤作用而对正常的细胞无杀伤作用的临界浓度值在1μmol/L和10μmol/L之间。 结论:本实验所构建的可删除标记基因表达载体有一定的应用价值,载体的MCS处可以插入不同的目的基因,为生产较为安全的转基因动物奠定了基础。TK、IRES、LoxP序列能完整的从重组载体pCMV-LoxP-TK-IRES-Red2上酶切下来,为构建其他载体、进行基因功能研究奠定了基础。