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H9N2禽流感NS1蛋白是该病毒的非结构蛋白,而且是一种多功能调节蛋白,能够抵制流感病毒感染所引发的宿主免疫反应,而且还可以导致多种传代细胞凋亡。在我们之前的研究中已经证实,H9N2禽流感病毒NS1蛋白能够诱导DF-1细胞发生凋亡。为了研究H9N2禽流感病毒NS1蛋白是否能够引起氧化应激以及氧化应激在其致凋亡作用中的影响,我们将质粒pEGFP-NS1转染DF-1细胞不同时间后,检测细胞内活性氧的累积情况及氧化还原信号的变化;将pEGFP-NS1转染DF-1细胞48小时,并设置空白对照组、空载体对照组以及抗氧化剂(PTDC和NAC)处理组,探索氧化应激对细胞凋亡的影响。研究结果如下:1.H9N2禽流感病毒NS1蛋白能够引起DF-1细胞产生氧化应激。我们于荧光显微镜下观察活性氧阴离子探针红色荧光发现,在pEGFP-NS1转染24小时后ROS的产生开始增多,并随时间延长而增加,通过流式细胞术定量检测进一步证实这一结果;超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的检测结果表明,两者的活性都随着pEGFP-NS1转染时间的延长升高;相对荧光定量PCR检测PRDX3和TRX的mRNA表达水平结果显示,pEGFP-NS1转染24小时开始,两者均有不同程度的下调。2.氧化应激促进H9N2禽流感病毒NS1蛋白诱导的DF-1细胞凋亡过程。本实验设置空白对照组、空载体对照组、pEGFP-NS1转染48小时、PTDC/NAC预处理的pEGFP-NS1转染组共5组细胞。经流式细胞术检测,各组凋亡率为:2.4%、4.0%、15.8%、12.8%、6.8%,抗氧化剂处理组细胞凋亡率明显低于实验组;caspase-3、caspase-8、caspase-9活性检测结果,抗氧化剂处理组细胞的caspase-3、caspase-9活性均降低,caspase-8活性变化不明显;Western Blotting检测活化的caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax及bcl-2的蛋白表达情况发现,与caspases活性检测结果相一致,抗氧化剂处理后活化的caspase-3、caspase-9的表达量降低,caspase-8表达量变化不明显,抗氧化剂处理后Bax的表达比实验组低,而bcl-2则比实验组要高。综上所述,本实验研究证实了H9N2禽流感病毒NS1蛋白能够诱导DF-1细胞产生氧化应激,且氧化应激参与其诱导的DF-1凋亡过程。且氧化应激可能通过内源性凋亡路径(线粒体依赖性凋亡途径)对H9N2禽流感病毒NS1蛋白诱导的DF-1细胞凋亡过程进行调节。