目的:广地龙为我国常用的动物类药材,在我国最早的中药学著作《神农本草经》中就已收载,其药用历史十分悠久,具有清热抗炎、抗惊厥、溶栓、平喘、利尿等功效,广泛应用于哮喘等呼吸道疾病的治疗。虽然广地龙有良好的平喘功效,但关于其抗哮喘分子机制的报道甚少。因此,本研究拟构建原代大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)的增殖模型,通过研究广地龙对ASMC增殖的影响作用,从细胞学和分子生物学水平探索广地龙治疗哮喘中气道重塑的作用靶点和作用途径,为广地龙开发新的治疗靶点和临床合理应用提供相关的理论基础和实验依据。方法:培养原代大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)的实验中,在无菌条件下从SPF级雄性SD大鼠分离出气管,并小心翼翼剥除结缔组织和脂肪,采用组织块法培养原代大鼠气道平滑肌细胞(ASMC),根据成纤维细胞和平滑肌细胞的贴壁时间不同,采用差速法纯化,并以荧光免疫反应鉴定其纯度。构建大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)增殖模型的实验中,取第3～6代的ASMC,以组胺(Hist)作为大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)增殖模型的诱导剂,选用四甲基偶氮唑盐法(MTT)考察Hist诱导ASMC增殖的成模浓度与时间范围。探索广地龙对平滑肌细胞(ASMC)增殖的影响及机制的实验中,将广地龙样品制备成不同浓度的水煎液,按照药典规定的广地龙用量,换算成大鼠用药量。以一定倍数稀释后作用于上一步构建成功的气道平滑肌细胞(ASMC)增殖模型,通过MTT法测定细胞数目以间接考察广地龙水煎液对ASMC增殖的影响。采用实时定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)测定气道平滑肌细胞中ERK1/2、Cyclind1 mRNA相对表达量,免疫印迹法(Western Blotting)测定磷酸化ERK1/2蛋白表达量以探索广地龙对ASMC增殖抑制的具体作用机制。结果:(1)在培养大鼠气道平滑肌(ASMC)的原代细胞实验中,本研究采用组织块法,操作简便快捷,污染概率小,可分离出高活力的ASMC原代细胞,3～4d可观察到有圆梭型小细胞爬出,5～6天则进入对数生长期,在25cm培养瓶中原代细胞细胞周期为6～7d,细胞状态稳定,产量高;并经过细胞免疫荧光反应,鉴定95%以上为大鼠气道平滑肌细胞(ASMC),为本文后续的研究提供了高活力和高纯度的气道平滑肌细胞(ASMC)作为研究对象。(2)在建立大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)增殖模型的实验中,本研究以组胺(Hist)作为复制气道平滑肌细胞增殖模型的诱导剂,采用1.Ommol/L的浓度对的气道平滑肌细胞(ASMC)进行12～24h的干预,能使气道平滑肌细胞(ASMC)数量明显增加,增殖效果明显,可成功构建体外ASMC增殖的模型。(3)在研究广地龙对平滑肌细胞(ASMC)增殖的影响及其机制的实验中,在不同剂量的广地龙水煎液作用下,ASMC数目随着剂量的升高而呈现先上升后下降的变化趋势,在0.01～0.2g/ml剂量范围内,ASMC数目显著增加,并高于阴性组的细胞数目(P<0.05),当广地龙水煎液的剂量高于0.2g/ml作用下时,ASMC数目开始下降,显著低于阴性组的细胞数目(P<0.05);剂量为0.25～1g/ml的广地龙水煎液均可显著降低ASMC中ERK1/2和Cyclind1 mRNA的相对含量(P<0.05),且随着广地龙水煎液剂量的增加,ASMC中ERK1/2和Cyclind1 mRNA的相对含量呈下降的趋势;而剂量为1g/ml广地龙水煎液能显著降低ASMC内p-ERK1/2的相对表达含量,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:广地龙水煎液能够有效的抑制大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)的增殖,发挥其抑制作用的机制可能是通过拮抗ERK1/2信号通路实现的,通过降低了 ERK1/2和Cyclind1的mRNA的表达量,降低了 p-ERK1/2蛋白的相对表达量,最终实现抑制ERK1/2信号通路的活性,从而抑制了大鼠气道平滑肌细胞的增殖,该结果可作为广地龙平喘疗效及其机制的科学依据之一。