【摘 要】
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糖尿病作为一种非传染性的、慢性代谢类疾病,由多种病因综合所致。最大的特点是慢性高血糖,并且伴随由于胰岛素分泌和/或作用缺陷而导致的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。传统治疗糖尿病的药物大多依赖于胰岛素或胰岛素代谢途径中的受体蛋白,往往忽视了脂代谢紊乱在疾病发展中的作用,当糖尿病患者发展到晚期出现较为严重的胰岛素抵抗时,即使加大用药量也难以发挥药物的治疗作用,反而会进一步恶化病情。因而迫切需要一种安全有效,
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糖尿病作为一种非传染性的、慢性代谢类疾病,由多种病因综合所致。最大的特点是慢性高血糖,并且伴随由于胰岛素分泌和/或作用缺陷而导致的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。传统治疗糖尿病的药物大多依赖于胰岛素或胰岛素代谢途径中的受体蛋白,往往忽视了脂代谢紊乱在疾病发展中的作用,当糖尿病患者发展到晚期出现较为严重的胰岛素抵抗时,即使加大用药量也难以发挥药物的治疗作用,反而会进一步恶化病情。因而迫切需要一种安全有效,既能调节血脂,又能改善胰岛素抵抗的综合性药物。人成纤维细胞生长因子21（human fibroblast growth factor 21,h FGF21）作为激素样蛋白的一种,可以有效地改善血脂紊乱,但却存在半衰期短和易被体内代谢等缺点,导致靶组织利用率低,限制了其临床应用。为了解决上述问题,本研究通过柔性连接肽（GGGGS）3将h FGF21的N端连接至人血清白蛋白（Human serum albumin,HSA）的C端,经过毕赤酵母密码子优化后,将重组基因片段r HSA-h FGF21连入两种载体（p PIC9k和p PICZαA）,并转化到三种不同酵母菌株（X33、GS115和SMD1168）中;通过加压筛选得到高表达的X33-p PIC9K-r HSA-h FGF21工程菌株,此时r HSA-h FGF21的表达量58.4 mg/L;随后通过优化摇瓶诱导条件,确定诱导初始OD600为1、甲醇浓度为1%以及诱导72 h的发酵条件,使r HSA-h FGF21的表达效率进一步提高至97.8 mg/L;培养上清经中空纤维膜切向流技术粗分离、Blue Bestarose亲和层析和40Q离子交换层析纯化获得纯度约98.18%的r HSA-h FGF21蛋白,总回收效率为37.23%。与h FGF21相比,r HSA-h FGF21具有更好的热稳定性和抗胰蛋白酶降解的能力,同时蛋白的药代动力学分析实验也表明,与h FGF21相比融合后r HSA-FGF21的半衰期延长了约27.6倍达到23.5h;中高浓度条件下r HSA-h FGF21刺激Hep G 2细胞摄取葡萄糖的能力优于h FGF21;体内研究表明,在每2天给药一次持续治疗14天的条件下,r HSA-h FGF21治疗组的2型糖尿病小鼠（db/db）血糖水平可以保持在较低水准（6.87-8.79 mmol/L）,即使停药4天其血糖仍然可维持在9.35 mmol/L左右,显著低于FGF21治疗组。表明r HSA-h FGF21比h FGF21具有更好的长效降糖效果。本研究筛选了一株高表达r HSA-h FGF21的毕赤酵母工程菌株。通过优化发酵条件及两步纯化后,使r HSA-h FGF21的纯度达到98.18%。经该方法纯化的r HSA-h FGF21蛋白不仅具有良好的体外稳定性、半衰期,而且其长效降糖活性显著优于未融合的h FGF21。本研究成功建立了在毕赤酵母中表达r HSA-h FGF21的生产技术和纯化工艺,对其未来的规模化生产奠定了基础。
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