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背景与目的感染性休克的主要临床表现就是败血症。由于败血症呈现出高度变化的临床特征,使得精确的早期诊断变得比较困难,晚期诊断和延迟治疗会大大增加死亡率。生物标志物是潜在的有价值的临床工具,虽然已经有许多早期诊断败血症生物标记的研究,但是大部分没有被采纳或者在临床实验中被证明有效。为了在败血症中发现新的诊断和预后指标,基因组学的方法被应用到败血症研究当中,结果显示许多miRNA都可以作为炎症反应的关键调控因子。miRNA作为免疫应答的调节器,在败血症当中有着重要的转录调控作用。虽然越来越多的研究表明许多miRNA在败血症当中是高表达的,但是这些分子在败血症中的病理学机制并未研究透彻。有研究表明miR-21-3p在LPS诱导的败血症相关的心脏功能紊乱中是高表达的,通过antagomiR对miR-21-3p进行药理性抑制后能够提高小鼠的生存率,但是具体机制还不是很清楚。因此本实验中研究了miR-21在内毒素休克中的作用并对其调节机制进行了探讨。方法体内实验对miR-21 KO鼠和WT腹腔注射LPS诱导内毒素炎症性休克模型,监测48 h内小鼠的存活情况并记录绘制生存曲线。另外LPS注射6 h后ELISA检测小鼠外周血血清中IL-1β和IL-18含量,同时用PBS清洗小鼠腹腔并吸出,离心获得腹腔巨噬细胞并对腹腔巨噬细胞进行流式检测M1和M2巨噬细胞的比例。为了更加直观看到miR-21敲除后对内毒素休克的影响,对小鼠进行腹腔注射LPS 12 h后对小鼠肝脏、脾脏和肾脏进行H&E染色观察炎症细胞的浸润情况。caspase-1的激活会导致IL-1β和IL-18的成熟和分泌,体外实验通过western检测小鼠BMDM在NLRP3炎症小体激活时caspase-1的活化情况,同时利用ELISA检测caspase-1激活时相应成熟IL-1β的分泌情况。对miR-21 KO和WT BMDM进行LPS预刺激4 h后采用ATP或尼日利亚杆菌刺激0 min,10 min,20 min,30 min,60 min后western检测caspas-1活化趋势,同时对应时间点的细胞上清用来检测caspase-1活化后IL-1β的分泌和LDH含量。在本实验中为了排除转染试剂和siRNA对AIM2炎症小体激活的影响,我们向BMDM中转染了dsDNA,通过western检测加入dsDNA后caspase-1的活化情况并利用ELISA检测细胞上清中IL-1β和LDH含量。有研究表明A20是NLRP3炎症小体的一个负向调节器,在随后的实验中我们通过western和qRT-PCR检测了miR-21 KO和WT BMDM中A20、NLRP3、caspase-1和ASC的表达情况,同时利用荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR实验验证A20是miR-21的靶基因。随后通过向miR-21 KO BMDM中转染si-A20,western和qRT-PCR检测NLRP3、caspase-1和ASC的表达,通过ELSA检测细胞上清的IL-1β分泌。大量的研究结果表明NLRP3炎症小体相关的caspase-1与线粒体功能失调相关。在本研究中通过检测ROS确定线粒体受损情况。caspase-1的激活会切割GSDMD,产生一个GSDMD-N,它是促使细胞焦亡的直接片段。我们通过向BMDM细胞转染Flag-GSDMD慢病毒,使用anti-Flag western检测GSDMD的切割情况,同时采用直接使用anti-GSDMD检测GSDMD的切割情况。结果体内实验中生存曲线结果显示在miR-21敲除后小鼠的存活情况明显优于对照组,血清中的IL-β和IL-18含量及腹腔巨噬细胞比例少于对照组,肝脏、脾脏和肾脏组织H&E染色显示miR-21 KO组的炎症细胞浸润明显少于对照组。体外实验结果表明NLRP3炎症小体在被LPS激活后能够导致caspase-1的活化,而caspase-1的激活会促进IL-1β的成熟和分泌。这一趋势会随着ATP或者尼日利亚杆菌激活NLRP3炎症小体的时间增长而加强。在miR-21 KO BMDM中,A20高表达,同时NLRP3、caspase-1和ASC在mRNA水平和蛋白水平低表达。A20是miR-21的一个靶基因,当在miR-21 KO BMDM中敲低A20后会恢复NLRP3、caspase-1和ASC的表达水平。在miR-21 KO BMDM中ROS的释放明显少于对照组。在caspase-1活化的同时发生了GSDMD-N诱导的细胞焦亡,但miR-21 KO组巨噬细胞的焦亡程度明显低于对照组。结论上述结果表明,miR-21敲除后在体内和体外都可以明显缓解LPS诱导的内毒素休克反应,降低炎症反应的程度。其机制是miR-21通过调节A20进而调节炎症小体影响细胞焦亡的发生,最终影响IL-1β分泌。