该实验提出以BDNF联合神经干细胞移植治疗AD模型鼠，利用BDNF促进移植的神经干细胞分化成新的胆碱能神经元，同时保护溃变神经元，刺激P75和PVmRNA的表达，增加P75和PV蛋白的含量，以便最大限度地改善空间学习记忆能力。 第一部分 BDNF与神经干细胞移植联合应用对AD模型鼠基底前脑的NGF-R和PV阳性神经元以及学习记忆能力的影响 一、材料和方法 1、新生SD大鼠的海马，机械分离，加入胰蛋白酶和DNA酶消化分散，制成单细胞悬液，加入含2％B27、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(终浓度均为10ng/ml)的DMEM/F12无血清培养基的培养瓶中，放置在37℃、5％CO2培养箱内培养。每天观察，将原代培养约5-7天形成的细胞球离心，按上述条件半量换液，吹打成单细胞悬液；以后每5-7天传代一次，方法同前。用免疫组织化学法，行Nestin染色，鉴定培养的细胞为神经干细胞。 2、成年雄性SD鼠24只，体重250-300克，随机分成4组，每组6只，分别为正常组、损伤组、移植组和联合组。损伤组单侧(左侧)切断穹隆海马伞(fimbria-fornix，FF)，以制备隔-海马通路损伤的AD模型鼠。将传至第3或4代的神经干细胞球吹打制成单细胞悬液，调整细胞浓度至约1×104/μl备用；移植组和联合组鼠建立模型(同损伤组)，即行同侧基底前脑神经干细胞移植。用10μl微量注射器取5μl细胞悬液，取坐标：前囟前0.6mm、旁开0.6mm，进针深5.5mm，20分钟内注射完毕。移植组鼠分开饲养一个月。联合组鼠移植后再行侧脑室BDNF注射，按坐标：前囟后0.8mm、左侧旁开1.5mm，用7号针头将颅骨钻一孔，以微量注射器取BDNF溶液(0.1μg/μl)5μl，20分钟内注射完毕。以后每三天在同一针孔注射一次，共一个月。分别在1、2、3、4周检测神经干细胞在体内的存活、迁移情况。各组动物一个月后行Y-迷宫空间学习、记忆能力的检测。测试后动物经灌注、固定、取脑、蔗糖渗透，冰冻切片。基底前脑切片行NGF-R、小白蛋白(PV)免疫组化染色，对内侧隔核(MS)、斜角带垂直支(VDB)的NGF-R阳性神经元和PV阳性神经元进行计数和形态学参数的测定；数据用SPSS统计软件包进行统计学处理。 二、结果 1、细胞培养海马神经干细胞能够在EGF和bFGF的刺激下分裂增殖，一周左右形成由数十到数百个细胞组成的克隆细胞球。传代后的神经干细胞经培养出现与原代培养相同的克隆细胞球，细胞形态不变。传至第4代的克隆细胞球Ne~in染色，结果呈阳性反应。 2、联合治疗对AD模型鼠基底前脑NGF-R阳性神经元的影响FF切断4周后，损伤组损伤侧基底前脑MS和VDB的NGFR阳性神经元大量减少，分别减少到正常组的61.3％和49.3％；MS和VDB的NGFR阳性细胞面积、周长及灰度值显著下降(P＜0.01)。移植组损伤侧的NGFR阳性神经得到补充和保护，MS和VDB的NGFR阳性神经元分别减少了34.1％和27.6％；明显高于损伤组损伤侧的NGFR阳性神经元存活数(P＜0.05)。联合组损伤侧MS和VDB的NGFR阳性神经元数分别减少15.1％和18.6％；分别高于损伤组和移植治疗组(P＜0.01)。细胞的周长、面积和灰度值明显改善(P＜0.05)。3、联合治疗对AD模型鼠基底前脑PV阳性神经元的影响 FF切断4周后，损伤组损伤侧的MS和VDB的PV阳性神经元大量减少，分别减少56.8％和38.2％；移植组损伤侧的PV阳性神经元得到补充，MS和VDB的PV阳性神经元数分别下降38.6％和20.1％。联合组损伤侧PV阳性神经元得到补充和保护，MS和VDB细胞数分别下降12.5％和10.3％，与损伤组和移植组比较有显著差异(P＜0.01)。细胞的周长、面积和灰度值明显改善(P＜0.05)。4、联合治疗对AD模型鼠空间学习记忆能力的影响 Y-迷宫分别测试4组大鼠空间学习记忆能力，正常组学习记忆次数分别为61.0±3.9、8.4±0.4；损伤组(115.0±8.4、3.5±0.5)均明显下降，P＜0.01；移植组(73.2±5.3、6.7±0.5)较损伤组有改善，P＜0.05，但与联合组比较有差异，P＜0.05；联合组(65.0±8.4、8.3±0.3)进一步改善，与损伤组比较，P＜0.01，而与正常组比较，P＞0.05，差异无显著意义。 5、线性相关分析将联合组学习次数r1、记忆能力r2分别与NGFR阳性神经元数进行相关分析，结果呈显著负相关和正相关关系，如MS：r1=-0.77，P＜0.01；r2=0.81，P＜0.01；VDB：r1=-0.79，P＜0.01；r2=0.76，P＜0.01。联合组学习次数、记忆能力分别与PV阳性神经元数目呈显著负相关和正相关关系，如MS：r1=-0.73，P＜0.01；r2=0.79，P＜0.01；VDB：r1=-0.80，P＜0.01；r2=0.85，P＜0.01。 第二部分 BDNF与神经干细胞移植联合应用对AD模型鼠基底前脑的P75和PVmRNA表达量的影响及与学习记忆关系 一、材料和方法 成年雄性SD鼠24只，体重250-300克，随机分成4组，每组6只，分别为正常组、损伤组、移植组和联合组。损伤组单侧(左侧)切断穹隆海马伞(fimbria-fornix，FF)，以制备隔-海马通路损伤的AD模型鼠。将传至第3或4代的神经干细胞球吹打制成单细胞悬液，调整细胞浓度至约1×104/μl备用；移植组和联合组鼠建立模型(同损伤组)，即行同侧基底前脑神经干细胞移植。用10μl微量注射器取5μl细胞悬液，取坐标：前囟前0.6mm、旁开0.6mm，进针深5.5mm，20分钟内注射完毕。移植组鼠分开饲养一个月。联合组鼠移植后再行侧脑室BDNF注射，按坐标：前囟后0.8mm、左侧旁开1.5mm，用7号针头将颅骨钻一孔，以微量注射器取BDNF溶液(0.1μg/μl)5μl，20分钟内注射完毕。以后每三天在同一针孔注射一次，共一个月。各组动物一个月后行Y-迷宫空间学习、记忆能力的检测。行为检测后将动物迅速处死，取损伤侧基底前脑，提取组织总RNA，并用随机引物逆转录为cDNA后，对目的片段进行特异性扩增，产物进行跑胶和凝胶分析，建立RT-PCR方法，检测P75和PVmRNA及β-actin基因表达量。并用SPSS软件包进行统计学分析。 二、结果 1、联合治疗对AD模型鼠基底前脑P75mRNA表达量的影响FF切断4周后，损伤组损伤侧的基底前脑P75mRNA表达量显著下降，损伤组与对照组分别为0.3819±0.0947，0.7851±0.1655，两者有显著差异(P＜0.01)。移植组损伤侧的基底前脑P75mRNA表达量为0.5274±0.1208，与损伤组、对照组比较均有显著差异(P＜0.05)。联合组损伤侧的基底前脑P75mRNA表达量为0.7920±0.1463，与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。 2、联合治疗对AD模型鼠基底前脑PVmRNA表达量的影响FF切断4周后，损伤组损伤侧的基底前脑PVmRNA表达量显著下降，损伤组与对照组分别为0.2407±0.0825，0.8536±0.1248，两者有显著差异(P＜0.01)。移植组损伤侧的基底前脑PVmRNA表达量为0.5016±0.1009，与损伤组、对照组比较均有显著意义(P＜0.01)。联合组损伤侧的基底前脑PVmRNA表达量为0.7745±0.1152，与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。 3、P75和PVmRNA的表达量与空间学习记忆能力的线性相关分析将联合组学习次数r1、记忆能力r2分别与P75mRNA表达量进行相关分析，结果呈显著负相关和正相关关系，如r1=-0.85，P＜0.01；r2=0.76，P＜0.01；联合组学习次数、记忆能力分别与PVmRNA表达量呈显著负相关和正相关关系，如r1=-0.82，P＜0.01；r2=0.69，P＜0.01； 小结 1、新生SD鼠海马提取的神经干细胞，能够利用无血清的培养基在EGF和bFGF刺激下传代、增殖，且能在宿主体内存活。 2、单侧切断FF后，基底前脑MS、VDB的NGFR阳性神经元、PV阳性神经元均大量丢失；且丢失与AD模型大鼠学习记忆能力减退密切相关。 3、BDNF和神经干细胞联合应用与神经干细胞单独应用，对基底前脑MS、VDB的NGFR阳性神经元、PV阳性神经元有不同程度保护作用，联合组效果较单纯移植组好。 4、BDNF和神经干细胞联合应用与神经干细胞单独应用，均可不同程度的提高基底前脑P75和PVmRNA的表达量，联合组增加的明显多于移植组。 5、BDNF和神经干细胞联用与神经干细胞单独使用，对AD模型鼠的空间学习记忆能力的改善均有效果，且联合组优于移植组。 总之，体外培养的神经干细胞能够在体内存活，可以作为治疗AD的细胞来源。BDNF和神经干细胞联合应用协同地保护和补充基底前脑神经元，明显提高了P75和PVmRNA的表达量，显著改善AD模型鼠的空间学习记忆能力。因此，BDNF和神经干细胞移植联合治疗AD是较理想的治疗方法。