结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,严重危害人类的健康。和其他肿瘤一样,其病因迄今尚未明确。近二十年来,由于我国人民饮食及生活习惯的改变,结直肠癌的发病率增长显著。转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因。因此,积极开展结直肠癌转移机制的研究对于结直肠癌的诊治具有十分重要的现实意义。Tiam1基因(T lymphoma invasion and metastasis,Tiam1)即T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1是我们利用自行设计、制备的肿瘤转移相关基因cDNA芯片并结合文献挖掘的生物信息学方法发现的一个与结直肠癌转移有密切关系的基因。Tiam1基因是Habets等在1994年从鼠的T淋巴瘤细胞高侵袭变异株中分离克隆,并根据其在T淋巴瘤中的作用特点命名的。其表达产物为Tiam1蛋白,是普遍存在的二磷酸鸟嘌呤核苷酸(GDP)与三磷酸鸟嘌呤核苷酸(GTP)转换因子,属于Rho三磷酸鸟嘌呤核苷酸水解酶(GTPases)家族。Tiam1是Rac和Rho活性的调节因子,通过参与Tiam1-Rac信号传递通路影响细胞骨架的重组、细胞粘附和运动,在肿瘤发展、侵袭和转移过程中发挥重要作用。我实验室前期的研究结果显示,Tiam1在结直肠癌组织中的表达要强于正常黏膜组织,且在发生转移的患者癌组织中的表达强度要高于未发生转移的患者。将外源性Tiam1转染入不表达Tiam1基因的结直肠癌细胞株HT29细胞中,发现其增殖、侵袭、体内成瘤及转移能力显著增强。而干扰掉内源性Tiam1基因的结直肠癌细胞株SW480细胞的这些恶性表型均不同程度的被逆转。以上结果表明,Tiam1为结直肠癌的促癌、促转移基因。结直肠癌细胞的远处转移是病人死亡的主要原因。因此,深入开展结直肠癌Tiam1表达调控机制的研究,将有助于进一步明确Tiam1在结直肠癌进展、转移过程中的作用,为结直肠癌的诊断和治疗提供切入点。现代肿瘤学认为,基因的突变、缺失等经典遗传学改变与基因的表观遗传异常共同作用导致肿瘤的发生。表观遗传是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下,基因表达发生了可遗传的信息变化,并最终导致了表型的改变。DNA甲基化是表观遗传学中非常重要的基因调控机制,目前对其的研究也最为深入。众多研究表明,几乎所有的肿瘤细胞中都存在着DNA甲基化谱的紊乱。与正常细胞相比,肿瘤细胞中普遍存在着基因组DNA整体低甲基化和局部区域高甲基化的特点。基因组内过低的甲基化会导致整个基因组的不稳定性增加,并能够使一些在正常情况下受到抑制的基因,如癌基因或相关因子得到大量表达,而启动子区域CpG岛的过度甲基化导致抑制基因的表达下调或失活,进而促进肿瘤的发生、发展。与经典遗传学改变不同的是,表观遗传学是一个可逆的化学修饰过程,因此可作为肿瘤治疗的靶点。例如,使用去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-aza-dC)抑制DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)的活性,使因甲基化而表达抑制的基因恢复表达,或者使用甲基化药物S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-l-methionine,SAM)抑制DNA的脱甲基作用,使因低甲基化而表达增高的基因受到抑制,从而逆转肿瘤细胞的恶性表型。本课题的目的是研究表观遗传学在结直肠癌Tiam1基因表达中的作用,重点阐明5’端CpG岛异常甲基化对Tiam1基因表达调控的影响。方法1.116例配对结直肠癌组织中Tiam1蛋白的表达及临床意义应用免疫组织化学S-P法,检测116例结直肠癌和配对的正常结直肠黏膜以及其中部分的区域淋巴结转移癌组织中Tiam1蛋白的表达与分布,并分析其与临床病理资料之间的关系。2.116例配对结直肠癌组织中Tiam1基因的甲基化情况及临床意义应用甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP),检测116例结直肠癌和配对的正常结直肠黏膜组织中Tiam1基因的甲基化情况。并分析其与蛋白表达之间的关系及其临床意义。3.结直肠癌细胞株中DNA甲基化调控Tiam1基因表达的作用研究及SAM对于部分结直肠癌细胞株生物学行为的影响四种结直肠癌细胞株(HT29、LS-174T、SW620、LoVo)经去甲基化药物5-aza-dC或甲基化药物SAM处理后,应用RT-PCR、免疫印记、免疫细胞化学、MSP方法观察其Tiam1 mRNA和蛋白的表达及其DNA甲基化情况的改变。SAM处理LoVo、SW620两种结直肠癌细胞株后,应用MTT、平板克隆、迁移实验、流式细胞术观察在过甲基化状态下结直肠癌细胞株的生物学行为变化。结果1.配对结直肠癌组织中Tiam1蛋白的表达免疫组化结果显示Tiam1在配对的正常结直肠黏膜、癌和淋巴结转移癌三种类型的组织中表达明显不同。两两比较发现,在配对的正常黏膜组织和肿瘤组织中,Tiam1蛋白的表达前者明显低于后者,差异具有显著性(Z＝-4.608,P＝0.000);淋巴结转移癌组织Tiam1表达要比配对的结直肠原发癌组织强(Z＝-3.115,P＝0.002);伴发区域淋巴结转移的癌组织比未发生转移的癌组织Tiam1表达明显增强,差异具有显著性(z＝-2.584,P＝0.01)。本研究结果提示,Tiam1蛋白表达与结直肠癌转移高度相关,即Tiam1表达弱或阴性者转移的发生率低,表达强者其转移发生率高。此外,我们的研究还发现,Tiam1的表达与肿瘤的分化显著相关,结直肠低分化癌中Tiam1的表达要低于高-中分化腺癌,差异具有显著性(Z＝-2.673,P＝0.008)。2.116例配对结直肠癌组织中Tiam1基因的甲基化情况及临床意义采用MSP法检测了116例结直肠癌组织及配对的正常粘膜中Tiam1基因的甲基化情况,并结合其表达进行分析。结果提示结直肠癌组织Tiam1的甲基化率低于配对的正常组织,差异具有统计学意义(Z＝-2.244;P＝0.025);经相关性检验,发现Tiam1基因的甲基化情况与其表达之间存在负相关性(r＝-0.494,P＝0.000)。经x~2检验,Tiam1基因的甲基化情况与患者的年龄和肿瘤的分化程度相关(P＜0.05)。也就是说在年龄低的患者中Tiam1基因的甲基化率要高于年龄高的患者,差异具有统计学意义(x~2＝4.838 P＝0.028);在低分化的肿瘤组织中Tiam1基因的甲基化率要高于高.中分化的肿瘤组织,差异具有统计学意义(x~2＝17.848P＝0.000)。3.结直肠癌细胞株中甲基化调控Tiam1基因表达的作用研究及SAM对于部分结直肠癌细胞株生物学行为的影响为进一步验证DNA甲基化与结直肠癌Tiam1基因表达调控之间的关系,我们用去甲基化药物5-aza-dC处理结直肠癌细胞株HT29和LS174T,并用甲基化药物SAM处理结直肠癌细胞株SW620和LoVo,分别采用RT-PCR、免疫印记、免疫细胞化学染色法检测药物处理前后结直肠癌细胞中Tiam1 mRNA和蛋白表达,MSP法检测Tiam1基因甲基化状态的改变。结果显示,5-aza-dC处理后的结直肠癌细胞中Tiam1 mRNA和蛋白均恢复表达或显著增强,MSP法检测证实该基因发生了去甲基化改变;SAM处理后的结直肠癌细胞中Tiam1 mRNA和蛋白的表达均显著降低,同样,MSP法检测证实该基因发生了甲基化改变。提示Tiam1在这些结直肠癌细胞中表达的改变是该基因甲基化状态改变的直接作用,表明DNA异常甲基化是结直肠癌Tiam1表达改变的直接调控机制。MTT法绘制细胞的体外生长曲线,经析因方差分析,不同处理组细胞差异具有显著性(LoVo:F＝705.056,P＝0.000;SW620:F＝489.138,P＝0.000);不同时间点对细胞体外增殖的影响差异具有显著性(LoVo:F＝646.360,P＝0.000;SW620:F＝1627.063,P＝0.000);各组细胞与各时间组两因素交互效应显著(LoVo:F＝42.223,P＝0.000:SW620:F＝40.435,P＝0.000);除第1天外,其他各时间点细胞组间的细胞增殖差异具有显著性。经LSD法多重比较,结果表明,与未处理组和S-腺苷高半胱氨酸(S-Adenosyl-L-homocysteine,SAH)处理组细胞相比,两种经SAM处理的细胞的增殖速度明显减慢,而未处理组和SAH处理组细胞的增殖速度无显著差异。平板克隆形成实验显示,经SAM处理的两种细胞的克隆形成能力均明显减弱,差异具有统计学意义(LoVo:F＝40.634,P＝0.000:SW620:F＝88.605,P＝0.000)。流式细胞术检测显示,SAM处理组结直肠癌细胞与对照组比较,LoVo细胞发生了S期阻滞,差异具有显著性(F＝106.826,P＝0.000);而SW620细胞发生了G1期阻滞,差异具有显著性(F＝166.932,P＝0.000)。运动小室实验证明,与未处理组和SAH处理组细胞相比经SAM处理的两株细胞的运动能力均减弱,差异具有统计学意义(LoVo:F＝25.855,P＝0.000:SW620:F＝36.358,P＝0.000)。结论1.Tiam1基因在结直肠癌组织中高表达,在局部转移的淋巴结中表达明显增强。研究结果进一步证实了Tiam1基因与结直肠癌发生、发展密切相关,是一种结直肠癌发生和转移促进基因;2.在结直肠癌中,Tiam1基因的5’端CpG岛甲基化水平降低,并且与该基因的表达呈负相关,表明DNA异常甲基化可能是结直肠癌Tiam1基因表达改变的重要调控机制之一;3.甲基化药物SAM不但具有诱导结直肠癌细胞株Tiam1基因甲基化从而下调其表达的作用,同时还具有抑制结直肠癌细胞的生长、阻滞细胞周期、降低结直肠癌细胞迁移能力等方面的作用。研究结果为SAM在结直肠肿瘤治疗方面的应用提供了重要的的实验和理论依据;4.甲基化水平提高所致的Tiam1表达下调可能在SAM改变结直肠癌细胞生物学行为中发挥一定的作用。