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目的:前列腺癌在我国发病率逐年增高,且随着年龄增加有递增趋势[1]。前列腺癌患者在患病前期没有明显的症状,目前也缺乏有效的早期诊断方法,少数在早期诊断出前列腺癌的患者多为正常体检时意外发现。多数患者在确诊时已经发展为晚期前列腺癌,丧失了前列腺根除术的合适时机[2-4]。因此及早诊断和治疗对前列腺癌患者至关重要。生物标记物检测对于恶性肿瘤的早期诊断近年来是临床研究的重点内容。Eya2（eyes absent homolog2）是EYA家族蛋白之一,具有高度保守的EYA结构域,该家族成员可以编码一系列转录辅助因子[5]。近些年来,一些研究表明Eya2参与一些癌症的发展,在包括肺癌,头颈癌,宫颈癌以及胶质瘤中等恶性肿瘤中均存在Eya2异常表达的现象[6-9]。在本课题研究中我们将探究Eya2在前列腺癌中的表达模式,临床意义,表达差异对前列腺癌细胞生物学功能的影响以及潜在的分子生物学机制,以判断Eya2是否可能作为前列腺癌早期诊断的生物标记物。研究方法:1组织样本98例人类前列腺癌组织和16例前列腺正常组织来自于2013至2016年在中国医科大学附属盛京医院就诊的患者。2免疫组织化学前列腺癌组织样本切除后浸入甲醛溶液固定,石蜡包埋处理并保存。制作石蜡切片,脱蜡后经抗原修复、BSA封闭后,滴加一抗（Eya2）孵育过夜。滴加生物素标记的二抗继续孵育。抗体孵育结束后DAB显色试剂盒显色,苏木素复染细胞核,脱水透化后进行封片。统计染色强度和阳性百分比,估算Eya2在前列腺组织中的表达情况。3细胞培养本实验所用细胞系为:人类前列腺上皮细胞RWPE-1（购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）,人类前列腺癌细胞DU145（购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）,LNCaP（购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）,PC-3（购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）,人类293细胞（购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。培养条件为:含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和链霉素的培养基,37℃恒温饱和湿度培养。4 Western Blot收集蛋白进行丙烯酰胺凝胶电泳,所用一抗为:Eya2、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、caspase3、PRAP、AKT、p-AKT、Bcl-2、MMP7和actin。样本经过辣根过氧化物酶耦合二抗孵育2小时,ECL发光。5实时定量RT-PCR使用TRIZOL提取总RNA,使用iScriptTM Reverse Transcription Supermix试剂盒进行反转录。RT-PCR使用SYBR Green MasterMix试剂采集荧光信号。所用仪器为ABI 7500。actin为内参基因,基因扩增倍数参照2-ΔΔct法。6 Eya2质粒转染和shEya2稳转Eya2 shRNA、pMD2.G和pspax2均购于Addgene公司,使用Lipofectamine 3000进行慢病毒转染,puromycin进行细胞筛选。Eya2质粒购于Addgene公司,使用Lipofectamine 3000进行Eya2质粒转染实验。7 CCK8和集落形成实验CCK8:重悬处理后细胞,以3000个细胞/孔的密度接种于96孔板,分别在24h、48h、72h、96h使用CCK8检测细胞增殖情况,绘制折线图观测Eya2表达差异对细胞增殖的影响。集落形成实验:重悬处理后细胞,均匀接种于6cm皿中,连续培养2周。固定后吉萨姆染色液染色,晾干后采集图像。对集落进行计数,分析Eya2表达差异对集落形成的影响。8 Transwell凝胶侵袭实验将处理后细胞重悬加至包被有Matrigel的Transwell上室中。Transwell上室血清浓度为3%,下室血清浓度为13%,37℃饱和湿度培养18h。取出上室,擦去上层Matrigel,固定打孔并使用苏木素染色。风干后裁下基底膜,中性树胶封片。对细胞进行计数,分析Eya2表达差异对细胞侵袭能力的影响。9细胞凋亡实验消化重悬细胞后离心,PBS漂洗一次。使用Annexin V/PI kit对细胞进行染色。流式细胞仪检测细胞凋亡水平的变化。10线粒体膜电位（JC-1）检测消化重悬处理后细胞,离心去除上清。以无血清培养基重悬细胞,加入CCCP作为阳性对照预染5min,加入JC-1染料37℃恒温饱和湿度孵育30min。孵育结束后离心并以室温PBS重悬细胞。流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位水平变化。11统计分析统计分析使用SPSS 17软件。用χ2检验法分析Eya2表达量与临床病理因素之间的相关性。采用t检验法分析各处理组之间所得数据。数据的表示方法为均值±标准差。p<0.05表示存在统计学意义。结果:1 Eya2在人类前列腺癌组织中高表达。免疫组织化学结果显示其在16例正常前列腺组织中有5例为阳性染色（31.3%）,在98例前列腺癌组织中有66例（67.3%）为阳性染色。Eya2过量表达与前列腺癌患者较高Gleason评分,TNM分期以及T分级显著相关。2 CCK8结果显示Eya2促进前列腺癌细胞增殖;集落形成实验表明Eya2增强前列腺癌细胞集落形成能力;凝胶Transwell实验结果显示Eya2促进前列腺癌细胞侵袭。3 Eya2影响前列腺癌细胞对多西紫杉醇的化疗敏感性。多西紫杉醇处理后,Eya2过表达提高前列腺癌细胞的活力;反之,敲除Eya2抑制前列腺癌细胞活力。Eya2过表达抑制多西紫杉醇诱导的细胞凋亡;反之敲除Eya2能够促进其凋亡水平升高。4 Eya2调节cleaved-caspase3、cleaved-PARP、caspase3、PRAP等蛋白的表达。Eya2表达上调后PARP和caspase3的表达量上调,cleaved-PARP和cleaved-caspase3的表达量下调。Eya2表达下调后,PARP和caspase3的表达量下调,cleaved-PARP和cleaved-caspase3的表达量上调。5 Eya2调控前列腺癌细胞的线粒体膜电位水平。Eya2过表达时,红色荧光强度增强,绿色荧光强度降低,细胞线粒体膜电位上升;反之,Eya2敲除后,红色荧光强度减弱,绿色荧光强度增加,细胞线粒体膜电位下降。6 Eya2活化AKT信号通路,调控bcl-2以及MMP7表达量。Eya2表达上调后Bcl-2和MMP7表达量增加,AKT磷酸化水平上调。Eya2过表达并予以AKT抑制剂刺激,显示Bcl-2表达量无明显变化。结论:Eya2在人类前列腺癌中高表达并与肿瘤组织较高Gleason评分,TNM分期以及T分级显著相关。Eya2增强前列腺癌细胞增殖和集落形成能力。Eya2促进前列腺癌细胞侵袭并上调MMP7蛋白表达水平。Eya2抑制细胞凋亡并上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。Eya2激活前列腺癌细胞中AKT/Bcl-2通路,调节前列腺癌细胞的线粒体凋亡途径,增强肿瘤细胞多西紫杉醇化疗耐药性。