论文部分内容阅读
目的:利用有限稀释法和连续传代法纯化体外培养的SD胎鼠脑室管膜下区的神经干细胞(Neural Stem Cells，NSCs)，并对两种方法纯化后的NSCs纯度及增殖能力进行比较。利用携带脑源性神经生长因子(BDNF，brain-derivedneurotrophic factor)的重组逆转录病毒建立体外稳定表达BDNF的胎鼠脑室管膜下区NSCs。探讨BDNF基因修饰的胎鼠脑室管膜下区NSCs联合雪旺氏细胞视网膜下腔移植后在正常SD大鼠眼内的迁移和分化情况。
方法:机械分离14.5天的SD胎鼠脑室管膜下区细胞，利用有限稀释法和连续传代法纯化NSCs，通过免疫细胞化学法鉴定胎鼠NSCs的纯度(Nestin阳性率)及分化细胞的类型。将两种方法纯化后的第3代NSCs以相同的密度接种后连续培养6周，每周进行细胞计数，绘制生长曲线。采用重组(pLXSN-BDNF)和空白逆转录病毒pLXSN分别感染体外纯化培养的NSCs得到BDNF-NSCs和p-NSCs，利用荧光定量PCR法和ELISA法检测BDNF-NSCs、p-NSCs和空白对照组NSCs中BDNF的基因和蛋白表达水平。GFP标记NSCs和雪旺氏细胞后进行正常SD大鼠视网膜下腔移植，分五组:单独NSCs移植组；BDNF-NSCs移植组；BDNF-NSCs联合雪旺氏细胞移植组；PBS组；空白对照组。采用多波长半导体激光视网膜脉络膜联合同步造影机(Heidelberg retina angiograph，HRA)、视网膜光学相干断层扫描仪(Optical coherence tomography，OCT)和免疫组织化学法检测移植的NSCs在视网膜内的存活、迁移和分化情况。
结果:有限稀释法和连续传代法纯化胎鼠脑室管膜下区NSCs的Nestin阳性率均高于原代培养的NSCs(31%±0.02%)，有限稀释法的Nestin阳性率(91%±0.03%)高于连续传代法(58.8%±0.02%，P<0.05)。有限稀释法纯化NSCs的生长曲线一直处于增殖趋势，而连续传代法纯化的NSCs前3周呈上升趋势，以后趋于平缓(P<0.05)。荧光定量PCR法和ELISA法测定BDNF-NSCs组表达BDNF水平高于p-NSCs和空白对照组，有统计学意义。HRA和OCT结果证实移植的NSCs能在宿主视网膜内存活良好，同时免疫组织化学法证实移植的NSCs能在视网膜内迁移并分化成神经元和神经胶质细胞。移植后3个月，联合雪旺氏细胞移植组的NSCs分化成神经元的数量最多。
结论:1、有限稀释法能有效地纯化体外培养的胎鼠脑室管膜下区NSCs，并保持了NSCs良好的增殖能力及多向分化潜能；2、携带BDNF的重组逆转录病毒能成功地将外源基因导入NSCs中；3、BDNF能促进移植的NSCs在视网膜内迁移和分化成神经细胞，雪旺氏细胞加强了这种作用。我们的研究为深入探讨青光眼病理机制-细胞移植治疗等提供依据和有价值的参考。