研究背景通过水传播的疾病严重威胁着人群的健康,世界卫生组织2002年公布的数据显示,人类80%的疾病与水相关,饮水污染以生物性污染为主,每年180万人死于腹泻病,88%的死亡病例与不洁饮水和水卫生状况有关。因此及时、准确的判断水的微生物污染状态和污染水平对于监测水的卫生状况和保证人群健康极为重要。肠道致病菌在环境中受到环境压力的作用下,除可以表现出适应、损伤、濒死和死亡等不同的方式外,还可以进入一种活的非可培养状态(Viable butnonculturable state,VBNC)。VBNC状态是指:细菌在特定因素的作用下,在常规培养基上不能生长,但细菌处于存活状态并具有代谢活性的状态;许多细菌包括病原微生物可进入这一状态;在正常状态下,这些细菌在常规培养基上往往能生长并形成菌落。细菌VBNC状态是细菌为适应不利环境条件的一种存活状态。细菌VBNC状态表现为:通过常规平板计数法检测,培养基上无菌落形成;用直接镜检法或细胞呼吸法检测细菌,细菌尚有代谢活性;细菌在宿主体内或者在适宜的复苏条件下,仍可复苏进行分裂繁殖。自上世纪80年代VBNC状态提出以来,发现包括霍乱弧菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌、志贺氏菌、李斯特菌、气单胞菌、嗜肺军团菌等60多种细菌存在这一状态,其中绝大多数是致病菌。处于VBNC状态的部分致病微生物可以保持毒力和致病性。如果因为粪便指示菌处于非可培养的状态而不能够检出,则低估了该指示菌在水中的浓度,必然低估了致病微生物对人体健康的潜在风险。因此需研究指示菌和致病菌在水环境中进入VBNC的诱因、处于VBNC状态的毒力和致病性、以及处于VBNC状态细菌检测方法。研究目的以大肠埃希氏菌、粪肠球菌、痢疾志贺氏菌(血清型1型)为目标菌株,研究细菌在水中处于VBNC状态的诱导因素以控制环境水样的采集、保存和检测方法;研究处于VBNC状态的志贺氏菌的细胞毒性、蛋白表达的差异性以探讨处于该状态细菌蛋白表达特性和分子机制;研究处于VBNC状态的细菌恢复培养方法,以提高其检出的阳性率。研究内容与方法1.用低温寡营养、低渗、低pH值、氯处理的方式处理目标菌株,研究肠道细菌在水环境中进入VBNC状态的诱导因素;2.用平板计数法测定可培养细菌数,用LIVE/DEAD细菌核酸荧光染色法检测细菌总数和活菌总数;3.用痢疾志贺氏菌感染体外培养的Vero非洲绿猴肾细胞、HT-29人结肠癌细胞来判断细菌产毒素情况和细菌的粘附力和侵袭力;4.用二维凝胶电泳分离细菌活的非可培养状态下和对数生长期的痢疾志贺氏菌表达的蛋白质,利用MALDI-TOF-MS分析差异蛋白,以探讨处于该状态细菌蛋白表达特性和分子机制;5.采用升温法、富营养培养法和添加化学物质法对低温寡营养诱导处于VBNC状态的细菌进行复苏培养,以期发现使处于VBNC状态的细菌复苏的条件。研究结果1.细菌进入VBNC状态的诱导因素研究1.1大肠埃希氏菌和在粪肠球菌4℃低温寡营养条件在水中诱导下90d、痢疾志贺氏菌42d可以完全进入VBNC状态;1.2 pH2.5的酸性环境下三种细菌很快的进入死亡状态(15d,15d,12d),不能进入VBNC状态而直接死亡;1.3 0.4 mg/L余氯作用30min使大肠埃希氏菌处于损伤状态,不能完全将细菌杀死,0.2mg/L余氯不能起到消毒作用,在氯的作用下,大肠埃希氏菌处于损伤状态而不是VBNC状态;1.4不同细菌诱导进入VBNC状态的条件有所不同,细菌对于环境条件的适用与耐受性决定细菌能否进入VBNC状态和诱导的时间。2.处于VBNC状态的志贺氏菌外毒素和致病性研究2.1处于VBNC状态的痢疾志贺氏菌血清型1型能使贴壁生长的Vero细胞丧失贴壁能力,而不能产生志贺毒素的大肠埃希氏菌和煮沸灭菌的痢疾志贺氏菌血清型1型均不能使贴壁生长的Vero细胞丧失贴壁能力,提示处于VBNC状态的痢疾志贺氏菌血清型1型能够表达具有细胞毒作用的志贺毒素;2.2处于VBNC状态的痢疾志贺氏菌血清型1型能够黏附HT-29肠道上皮细胞,提示处于VBNC状态的痢疾志贺氏菌血清型1型具有黏附因子,仍具有潜在的致病能力;2.3处于VBNC状态的痢疾志贺氏菌血清型1型能够侵袭HT-29细胞,提示处于VBNC状态的痢疾志贺氏菌血清型1型具有感染性;2.4处于VBNC状态的痢疾志贺氏菌血清型1型表达外毒素的量、黏附性和侵袭性低于对数生长期。3.处于VBNC状态的志贺氏菌蛋白表达的研究3.1细菌的代谢状态发生改变,分解代谢加强,合成代谢减弱;3.2有氧呼吸能力变强,厌氧呼吸减弱,提示细菌厌氧生存能力减弱;3.3外源核苷酸分解利用能力下降、细菌糖和蛋白的合成能力下降,细菌的分裂繁殖能力降低;3.4对高渗环境的抵抗力下降,对低温寡营养的抵抗力增强。4.处于VBNC状态细菌的复苏研究4.1升温法、富营养培养法和添加吐温-80不能将低温诱导的处于VBNC状态的大肠埃希氏菌、粪肠球菌和痢疾志贺氏菌复苏;4.2过氧化氢酶可以将处于VBNC状态的大肠埃希氏菌成功复苏,最适复苏浓度为1000U/皿;丙酮酸钠可以将处于VBNC状态的大肠埃希氏菌成功复苏,最适复苏浓度为50 mg/皿;4.3过氧化氢酶和丙酮酸钠不能将所有处于VBNC状态的细菌复苏,比起常规的平板计数法,复苏的效率可以提高1000倍,但是仅仅能够复苏所有活菌总数的1‰,尚需研究其它复苏措施;4.4通过复苏培养的方法可能会极大低估细菌在水中污染水平,应考虑研究其它检测方法。研究结论1.肠道致病菌在水中低温寡营养下能够进入VBNC状态;2.处于VBNC状态的痢疾志贺氏菌血清型1型能够表达志贺毒素,具有黏附性和侵袭力;3.处于VBNC状态的细菌分解代谢能力加强,合成代谢减弱,蛋白合成能力下降,分裂繁殖能力降低;4.过氧化氢酶和丙酮酸钠可以将处于VBNC状态的大肠埃希氏菌复苏,比起常规的平板计数法,复苏的效率可以提高1000倍,但是仅仅能够复苏所有活菌总数的1‰,尚需研究其它复苏措施和检测方法。