研究背景开放伤口由于皮肤完整性遭到破坏,失去了正常防御细菌的屏障能力,创面的坏死组织和含有大量蛋白质的渗出液又是细菌繁殖的良好培养基,在多种因素的作用下,创面容易发生局部感染、甚至引起全身感染,最终引起愈合时间的延长。近些年以来,研究逐渐发现,伤口在湿润的环境下比干燥的环境下要愈合得快,如果创面皮肤局部浸渍,会削弱宿主抵御细菌侵袭的防御屏障,但另一方面,在干燥条件下,细胞的活动反而受到抑制,会形成痂,并进一步发生组织坏死的可能,影响伤口愈合盥。由此思路出发,研制一种具有高吸收性、又能保持创面湿润的敷料,对于治疗外科感染伤口和慢性溃疡性创面,具有重要意义。随着现代医学的发展及生物材料的广泛应用,目前认为一款理想的敷料需具备以下几种生物学性能：①可大量吸收创面的渗出物,同时又能保证创面具有一定湿度；②具有良好的生物相容性；③易去除性,即移去敷料时不会造成伤口二次损伤；④具有一定的抗菌性；⑤生物可降解性能,不会造成环境污染。由海藻酸盐加工得到的海藻酸纤维含有多种氨基酸,具有良好的生物相容性,在钙离子的存在条件下可交联形成网状开放晶格的水凝胶,具有很好亲水性的水凝胶,可使得包埋在其中的细胞进行以渗透扩散为主的营养和代谢物质交换[4],同时为伤口提供湿润的愈合环境。以海藻酸盐为原料研发的海藻酸钙纤维具有无毒性、高吸水成凝胶性、良好的生物相容性、易去除性、良好的生物降解性、止血性能、能促进伤口愈合等优越特性,因而被广泛用于材料植入、人工牙体、生物填充等。此外,海藻酸盐纤维来源广泛,加工工艺简单,加工过程无毒性物质加入,制造成本低廉,是一种性价比较高的生物材料。银作为抗菌剂使用由来已久,银离子、可溶性银化合物、表面积大的胶态银、纳米银等均具有杀灭细菌、真菌的特性。其中纳米银是以纳米技术为基础研制而成的新型抗菌产品,其依靠着量子效应、小尺寸效应和具有极大的比表面积,因而具有传统无机抗菌剂无法比拟的抗菌效果。此外,纳米银粒子具有很强的渗透性,能渗透到皮下组织,与切口接触后迅速持久地释放纳米银,快速有效地杀灭切口及缝线上的病原体。如今,以纳米银为基础的抗菌产品在临床上得到了广泛的应用。本课题在海藻酸盐溶液中加入一定量羧甲基纤维素,并利用湿法纺丝得到改性后的海藻酸钙羧甲基纤维复合物,最后利用浸渍富集法制备载纳米银海藻酸钙抗菌敷料,该敷料的研制对防治外科伤口感染、促进慢性伤口愈合等有重大的意义。目的研制载纳米银海藻酸钙抗菌敷料,并对其物理学表征进行检测,充分评价其细胞毒性、抗菌性能及生物相容性,从中筛选出最适载银量的抗菌敷料,为其作为优质敷料进一步应用于防治外科感染伤口、促进伤口愈合提供最佳的选择。方法1、载纳米银海藻酸钙敷料的制备本课题采取的是湿法纺丝+浸渍富集法制备载纳米银海藻酸钙敷料,方法如下：湿法纺丝：将海藻酸钠、羧甲基纤维素纳按8.5：1.5比例放入水溶液中,高速搅拌,形成粘稠溶液,脱泡过滤后通过喷丝孔挤出到含有钙离子的凝固浴中,形成固态海藻酸钙羧甲基纤维长丝。该长丝经过拉伸、水洗、脱水干燥、卷曲形成纤维,纤维可梳理成网而制成非织造布。浸渍富集法：2000mg/L的纳米银溶液用去离子水稀释成不同浓度的纳米银溶液,加入等量海藻酸钙羧甲基纤维素敷料后37℃恒温震荡30分钟,后经脱水、乙醇洗涤,温度梯度烘干,-20*(2过夜,制成质量分数为0.5%、1%、2%、4%的载纳米银海藻酸钙羧甲基纤维素复合物,简称：载纳米银海藻酸钙抗菌敷料,AgNPs-Ca。2、载纳米银海藻酸钙敷料的物理学表征检测2.1紫外-可见光分光光度计检测敷料吸收光谱特征将样品浸泡于去离子水中,摇荡30min,过滤器滤去海藻酸钙纤维,并将最终溶液置于NanoDrop2000紫外-可见光分光光度计,设置0.5nnm扫描间隔,最后获取粒子分布曲线。2.2光学显微镜下的敷料样品取小量样品尽量撕拉成分散纤维,置于载玻片上,滴加树脂后封片干燥,制成可长期保存的敷料玻片。将玻片置于OLYMPUS光学显微镜上观察,拍照。2.3敷料样品的电子显微结构分析将载纳米银海藻酸钙敷料裁剪成8X8mm,厚5mmm,并置于60*(2烘干机、2小时彻底干燥,戊二酸及锇酸双固定标本,以离子溅射镀膜法将铂蒸发后覆盖在样品上,将处理好的样品置于扫描电子显微下,观察载纳米银海藻酸钙敷料中纤维及纳米银的形态、分布情况。3、载纳米银海藻酸钙敷料的细胞毒性检测将普通敷料、海藻酸钙敷料、0.5%-AgNPs-Ca、1%-Ag Ps-Ca、2%-AgNPs-Ca、 4%-AgNPs-Ca、Ag+-Ca等7个组的样品浸提液各2ml,分别置于35mm细胞培养皿内,加入2×104/ml LO2细胞悬液2ml,置于培养箱24h,使用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。将100ul浓度为6X1 04/mL的细胞悬液接种于96孔培养板,细胞贴壁后弃原液,将普通敷料、海藻酸钙敷料、0.5%-AgNPs-Ca、1%-AgNPs-Ca、2%-AgNPs-Ca、 4%-AgNPs-Ca、Ag+-Ca等7个组的样品浸提液各100 μl,置于细胞培养箱孵育24小时。采用CCK-8法测定L02细胞培养的相对增殖率(RGR),评价材料的细胞毒性。4、载纳米银海藻酸钙敷料的抗菌性能检测4.1抑菌圈实验挑选金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌菌落,制成1X106cfu/ml的菌悬液,用棉拭子粘取菌悬液在培养板沿着三个方向均匀涂划,最后将棉拭子在培养板边缘涂抹一圈,盖好干燥5min。将培养板均分为5部分,沿着顺时针方向依次放入海藻酸钙敷料、0.5%-AgNPs-Ca、1%-AgNPs-Ca、 2%-AgNPs-Ca、4%-AgNPs-Ca的l0mm圆片,最后放入37℃C02培养箱中培养18-20h,拍照后,使用Image J软件测绘,得到抑菌圈直径。4.2振荡抑菌实验在离心管中加入5ml细菌浓度3X104cfu/ml的菌液,并将普通敷料、海藻酸钙敷料、0.5%-AgNPs-Ca、1%-AgNPs-Ca、2%-AgNPs-Ca、4%-AgNPs-Ca、Ag+-Ca等7组实验敷料分别裁剪成10X10mm的正方形样片,经紫外线消毒2h后,各取2块放入离心管中。25℃,转数为200r/min,分别于振荡前、振荡1h后、2h取100ul涂板,培养箱培养18h后计数,计算1h、2h抑菌率,并筛选出合适浓度进行下一步实验。4.348小时长效抑菌检测在离心管中加入5ml细菌浓度3X104cfu/ml的菌液,并将普通敷料、海藻酸钙敷料、1%-AgNPs-Ca、Ag+-Ca分别裁剪成lOX1Omm的正方形样片,经紫外线消毒2h后,各取2块放入离心管中。25℃,转数为200r/min,振荡2h,后将离心管放置于37℃细菌培养箱中。分别于振荡前、振荡后2h、4h、6h、24h、48h六个时间点,取100ul样液,均匀涂于营养琼脂培养板中。将所有培养板放入37℃培养箱中,培养18h后计数。5、载纳米银海藻酸钙敷料的促创面愈合能力检测将24只Wistar大鼠分为4组,经麻醉、备皮后,环形切除背部全层皮肤,面积约180mm2,制成皮肤缺损的大鼠模型,分别接受1%-AgNPs-Ca、Ag+-Ca、海藻酸钙敷料、普通敷料处理,定期更换敷料,并于术后当天及第4、8、10天观察记录创面恢复情况,使用ImageJ软件测量创面面积,计算各时间点创面愈合率。随机选取术后第4、8天的各组大鼠,行皮肤创面组织活检,多聚甲醛固定后使用石蜡包埋,经HE染色后于镜下观察。6、载纳米银海藻酸钙敷料的生物相容性检测按国家GB/T 16886-2008和ISO 10993.12-2009标准要求,对制备的1%载纳米银海藻酸钙抗菌敷料进行溶血实验、急性全身毒性实验,以综合评价其生物相容性。6.1溶血实验：取5ml受试样品浸提液(1%载纳米银海藻酸钙抗菌敷料浸提液)、5m1生理盐水(阴性对照组)、5m1去离子水(阳性对照组),分别加入0.1ml的新鲜抗凝稀释兔血,肉眼观察是否出现明显的溶血现象；酶标仪检测各祥本上清液的吸光度,评价受试材料的体外血液相容性。6.2急性全身毒性实验：按1ml/20g剂量标准,于无菌条件下将1%载纳米银海藻酸钙抗菌敷料浸提液注入试验组小鼠腹腔内,阴性对照组注入生理盐水,阳性对照组注入苯酚。给药后连续7天观察小鼠,记录小鼠进食水、运动等一般情况、毒性反应、体重变化或死亡。结果1、载纳米银海藻酸钙敷料的物理学表征检测紫外-可见光分光光度计分析载纳米银海藻酸钙敷料的吸收峰位于416nm处,此外其分布范围在350-550nm之间。而未添加纳米银的海藻酸钙敷料的紫外光谱则没有特殊的吸收峰。扫描电子显微镜下的载纳米银海藻酸钙敷料,海藻酸钙纤维大小均一,直径在10～15 μ m之间,敷料中纳米银呈规则的球形,粒径在80-100nm之间,附着于海藻酸钙纤维表面及空隙之间。2、载纳米银海藻酸钙敷料的细胞毒性检测不同实验组之间细胞增值率差异具有统计学意义(F=305.04,P<0.001)经24h培养,海藻酸钙敷料组细胞相对增值率(RGR)为99.66%,细胞毒性反应0级；0.5%-AgNPs-Ca组与1%-AgNPs-Ca组L02细胞的RGR分别为94.0%和92.8%,细胞毒性反应I级,无细胞毒性,两者之间差异无统计学意义。2%-AgNPs-Ca组L02细胞RGR为69.4%,细胞毒性反应工工级,轻度细胞毒性。4%-AgNPs-Ca组与Ag+-Ca组L02细胞RGR分别为27.2%、23%,细胞毒性反应III、工V级,均为中度细胞毒性。3、载纳米银海藻酸钙敷料的抗菌性能检测3.1抑菌圈实验未添加纳米银的海藻酸钙敷料在四个菌株中均未见明显抑菌圈,而添加了不同浓度纳米银的四组海藻酸钙敷料其抑菌圈大小呈浓度依赖性。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌四个菌株中,0.5%-AgNPs-Ca所产生的抑菌圈大小介于11.8~13.6mm,1%-AgNPs-Ca所产生的抑菌圈大小介于13.0~14.7mm,2%-AgNPs-Ca所产生的抑菌圈大小介于13.5~16.2mm,4%-AgNPs-Ca所产生的抑菌圈大小介于15.3～18.Omm。3.2振荡抑菌实验对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌的1h抑菌率比较,普通敷料组均为0%；海藻酸钙组为13.9%、0%、7.4%、9.7%；0.5%-AgNPs-Ca组为58%、26.1%、45.7%、79.3%；1%-AgNPs-Ca组为74.6%、48.7%、57.2%、90.4%；2%-AgNPs-Ca组为96.8%、60.1%、62.9%、95.4%；4%-AgNPs-Ca组为99.7%、88.7%、67.9%、100%; Ag+-Ca组为50.4%、98.3%、72.0%、37.9%。对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌的2h抑菌率比较,普通敷料组均为0%；海藻酸钙组均为0%; 0.5%-AgNPs-Ca组为90.9%、87.8%、85.0%、95.6%;1%-AgNPs-Ca组为97.2%、98.0%、89.4%、97.8%;2%-AgNPs-Ca组为99.7%、98.0%、93.8%、99.1%; 4%-AgNPs-Ca组为100%、100%、98.5%、100%;Ag+-Ca组为82.9%、100%、98.0%、90.4%。结合细胞毒性检测结果、抑菌圈及振荡抑菌法结果,筛选出载银量1%的海藻酸钙敷料,用于下一步实验。3.348小时长效抑菌实验经普通敷料组与海藻酸钙组处理的四个菌株细菌数量均在4h时出现明显的增加,到24h时,细菌浓度达到峰值,大概浓度介于108~109cfu/ml之间,第48h未见明显增加。1%-AgNPs-Ca组对四个菌株具有类似的抑制曲线,2h时细菌浓度出现明显下降,4h时已无法检测到细菌的存在,并维持48h。Ag+-Ca组对四个菌株的抑制曲线类似于1%-AgNPs-Ca组,但Ag+-Ca组对大肠杆菌可以在2h时即达到100%的抑制率,并在接下来的48h内无法检测到细菌的存在。4、载纳米银海藻酸钙敷料的促创面愈合能力检测第4天,四组的创面愈合率无明显差别,愈合率大约为20%；第8天,AgNPs-Ca组的创面愈合率为70.2%,与Ag+-Ca组、海藻酸钙组、普通敷料组三组对比,P值均小于0.05,愈合率差异具有统计学意义；Ag+-Ca组愈合率为50.9%,海藻酸钙组愈合率为55.9%,两组之间愈合率未见明显差异。另外AgNPs-Ca组、Ag+-Ca组、海藻酸钙组的创面愈合率与普通敷料组(37.4%)对比,P值均小于0.05。5、载纳米银海藻酸钙敷料的生物相容性检测溶血实验：受试的1%-AgNPs-Ca浸提液没有引起体外溶血反应,1%-AgNPs-Ca抗菌敷料的溶血率为2.79%。急性全身毒性实验：实验组的小鼠在注射浸提液后,进食、呼吸、活动、排泄均未发现异常,在七天的观察期里,小鼠体重呈增加的趋势,未发现惊厥、步态不稳、狂躁等毒性反应,也没有出现死亡病例。结论1、本课题用湿法纺丝制得海藻酸钙羧甲基纤维素复合物纤维,再经浸渍富集法制备了载纳米银海藻酸钙抗菌敷料,通过实验证实并筛选的1%载纳米银海藻酸钙抗菌敷料具备优良的抗菌性能、促创面愈合能力和优异的生物相容性。2、通过紫外-可见光分光光度法及扫描电子显微镜观察证实,载纳米银海藻酸钙敷料可在水中溶解出纳米银颗粒,并具有较低的分散性,另外,海藻酸钙纤维直径均一,纳米银颗粒于纤维表面分布均匀。3、细胞毒性检测证实载纳米银海藻酸钙敷料的细胞毒性呈浓度依赖性,其中0.5%、1%-AgNPs-Ca属于无细胞毒性。4、根据QB/T 2591-2003规定材料对微生物的抑菌率>90%才能被称为抗菌材料,通过抑菌圈及振荡抑菌法证实载纳米银海藻酸钙敷料具有优良的抗菌性能,其中1%-AgNPs-Ca被证实具有长效抑菌的能力。5、动物实验证实载纳米银海藻酸钙敷料可明显提高创面的愈合速度,减轻创面的炎症反应,减少换药时的二次损伤。6、根据GB/T 16886-2008及IS010993-2009的系列标准对于生物材料生物相容性的要求及检测方法,1%-AgNPs-Ca不引起溶血反应、不具备急性全身毒性反应。1%载纳米银海藻酸钙抗菌敷料具有良好生物相容性,为进一步作为抗菌敷料应用于临床提供了有力的实验依据。