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大豆灰斑病是一种由Cercospora sojina Hara引起的世界性病害,该病原菌具有侵染性强、生理小种多、危害性大等特点,能够侵染大豆植株地上部分的所有器官。中国东北春大豆产区的气候正好适合其发生发展。近些年随着种植结构的调整,黑龙江省出现了一个新的强毒力菌株Race15,该菌株的出现导致了许多大豆主栽品种的抗性逐渐丧失。为了探明毒力变异的原因,本研究利用Illumina+Pac Bio测序技术对强毒力菌株Race15进行全基因组测序,明确其基因组遗传特征,再利用比较基因组学与弱毒力菌株Race1进行比较,分析两者基因组结构与组成的差异,挖掘影响毒力的特有基因。然后利用30株毒力差异菌株的重测序数据,通过构建进化树获得菌株间的物种进化关系,结合菌株毒力性状进行全基因组关联分析,深入探讨导致毒力差异的分子机制。最后用RNA-seq技术对灰斑病菌强、弱毒力菌株的转录组进行分析,拟发现两个毒力差异菌株在氮饥饿条件下具有的互作特异性生物途径及毒力相关差异表达基因,进而了解其毒力变化原因以及侵染机制。灰斑病菌基因组学的研究为进一步推动毒力相关基因鉴定与功能分析,真菌与植物互作机制及分子抗病育种等研究奠定良好基础。主要研究结果如下:1.通过对大豆灰斑病菌Race15的全基因组de novo测序,得到6038283778 bp的数据,经过组装得到12个contigs,N50长度为4.9 Mb,组装后得到的总序列长度为40.12Mb。共预测到12607个编码基因,基因密度约314个/Mb,预测得到了200个t RNA,2个s RNA和13个sn RNA。共有680个基因注释到病原与宿主互作数据库中,340个基因注释到碳水化合物酶数据库中,777个基因预测为次生代谢物相关基因,此外还有766个基因预测为分泌蛋白。这些毒力相关的致病基因主要涉及细胞壁分解酶、真菌的形态构成、毒素和色素生物合成等。研究发现灰斑病菌含有大量参与毒素生物合成的聚酮化合物(polyketide synthases,PKS)和非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptidesynthases,NRPS)基因,在侵染过程中显著上调表达,推测灰斑病能够产生尾孢菌毒素;同时还发现大豆灰斑病菌侵染过程中缺乏碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM1)基因表达,CBM1主要提高植物细胞壁不溶纤维素的水解效率,CBM1的缺失是导致灰斑病菌侵染过程缓慢的原因之一。2.通过对Race15和Race1比较基因组分析,发现Race15与Race1基因组显示出较高的覆盖度和共线性,但也有大量的易位、倒置和易位兼倒置。两个基因组存在大量平行同源基因,417个簇含有3个以上的平行同源基因,最大的簇含有210个平行同源基因。菌株Race15与Race1相比,245个特有基因中有41个基因注释在毒力相关数据库中,包括分泌蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、1,4-β-木聚糖酶、NRPS和PKS等,其中基因Vtc4在PHI数据库中注释为病原菌毒力增强。Vtc4基因影响多磷酸盐储存、菌株形态构成、黑色素生物合成和菌株毒力。其余特有基因也有可能与毒力差异有关。3.系统发育进化树显示,大多数菌株都存在着较近的祖先进化关系,系统发育树揭示菌株WQ和DH出现了孤立分支,其余30个菌株在一个大的分支上。进化树显示大多数菌株都存在较近的祖先进化关系,这与所采集菌株具有较近的地理位置是相符的。4.通过全基因组关联分析的三种生物信息学方法取交集筛选出5个重要毒力相关基因,其中4个都位于contig3上,1个位于contig1上,这与曼哈顿图检测出的毒力相关区域相符。A05389基因注释为为α-L-鼠李糖苷酶,参与克服皂苷介导的植物防御系统。A00784基因注释为纤维二糖脱氢酶,被证实参与寄主纤维素降解。剩余3个基因注释为NRPS,被证实参与真菌毒素及黑色素生物合成,这些基因在灰斑病菌侵染寄主的过程中起到关键作用。5.比较转录组学研究发现Race1和Race15在氮饥饿处理之前就存在差异。通过对差异表达基因的注释,共鉴定出54个毒力相关差异表达基因。其中上调差异表达基因小柱孢酮脱水酶和1,3,8-三羟基萘还原酶被注释为导致病原菌毒力增强,它们均与黑色素生物合成有关。菌株Race15和Race1经过氮饥饿处理后,共有31个毒力相关差异基因,其中上调差异表达基因Vtc4不仅注释为增强毒力,而且是Race15的特有基因,也注释在毒力相关绿色模块中。6.Green和Red模块基因在Race15菌株氮饥饿处理24 h的三个样品中均呈现高表达,这两个模块基因与氮饥饿胁迫下Race15的功能和发育有关。两个模块共有36个毒力相关基因,主要注释为β-1,3-葡聚糖酶、NRPS、α-甘露糖基转移酶和β-1,4-木聚糖等,这些基因主要参与真菌色素生物合成、植物细胞壁纤维素、木质素水解和真菌形态构建等。在Race15-LN vs.Race1-LN组与强毒力相关的红色和绿色模块中富集了大量的NRPS基因,但未发现PKS,推测NRPS也是导致毒力差异的原因之一。