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血小板生成因子(TPO)是一个非常重要的造血调控因子。经过几十年的不懈努力，基本上阐明了血小板生成因子及其受体系统(TPO/c-Mpl)在造血调控方面的作用，并在此基础上，研制了重组人血小板生成因子(rhTPO)，以治疗放疗和化疗等引起的血小板减少症。研究表明TPO是促进巨核细胞增殖、分化、成熟以及血小板产生的最基本的调控因子。此外，TPO可单独作用于原始造血干细胞和巨核细胞潜能的造血祖细胞，保护其生长，扩增其数量，并可与干细胞生长因子(SCF)、白介素11(IL-11)和红细胞生成素(EPO)等其它造血生长因子协同作用于造血祖细胞，促进其增殖。
本试验首先观察了国产重组人血小板生成因子(rhTPO)对辐射引起的C57小鼠骨髓抑制的治疗作用；然后观察了rhTPO对用环磷酰胺后猕猴的骨髓有核细胞增生情况的影响；并进一步利用MTT法、流式细胞术和透射电镜等方法研究rhTPO对辐射所致MO7e细胞凋亡的影响来探讨其调控造血系统的可能的机制。
一．rhTPO对辐射所致C57小鼠骨髓抑制的影响
雄性C57小鼠75只，经坞<137>铯γ射线4 Gy单次全身辐射，造成骨髓抑制。于辐射前及辐射后不同时间采血，测定血小板计数、白细胞计数和血红蛋白量。根据辐射前血小板计数分层，小鼠随机分成5组：溶媒对照组，rhIL-11组，rhTPO低、中、高剂量组。在全身辐射后第5天开始，分别皮下注射给予柠檬酸缓冲液，rhIL-11 150 μg·kg<-1>， rhTPO 4.5， 9和18μg·kg<-1>，每天给药1次(rhIL-11分两次给药)，连续给药22天，给药容积为10 mL·kg<-1>。实验结束后称体重，颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏和一侧股骨，称脾脏重量，计算脾重/体重比，并用紫外分光光度法测定骨髓DNA含量。结果显示给药第8天开始到实验结束(给药第22天)，rhIL-11组， rhTPO 4.5， 9和18μg·kg<-1>组小鼠血小板计数增加幅度明显大于对照组(P<0.01)；其中，rhTPO 9和18μg·kg<-1>组的增幅较rhTPO4.5μg·kg<-1>和rhIL-11组大(P<0.01)。在给药第22天，rhTPO 18μg·kg<-1>组的增幅较rhTPO 9μg·kg<-1>组大(P<0.01)。给药第15和22天，IL-11组小鼠白细胞计数增加幅度明显大于对照组(P<0.01)，而rhTPO 4.5和9μg·kg<-1>组小鼠在给药第22天时其白细胞计数的增幅才比对照组明显增加(P<0.01，P<0.05)。rhTPO 4.5，9和18μg·kg<-1>组小鼠脾脏重量和脾重/体重比与对照组比较无明显差异(P>0.05)。rhTPO 9μg·kg<-1>组小鼠骨髓DNA含量比对照组明显增加(P<0.05)。
二．rhTPO对用环磷酰胺后猕猴骨髓细胞的影响
猕猴20只，静脉注射环磷酰胺50 mg/kg，每天1次，连续2天，造成骨髓抑制。随机分成4组：溶媒对照组，rhIL-11组，rhTPO低和高剂量组。用环磷酰胺后第3天开始，分别皮下注射给予柠檬酸缓冲液，rhIL-11 62.5μg·kg<-1>，rhTPO 3和9CC，每天给药1次，连续给药20天，给药容积为0.1 mL·kg<-1>。给药第22天肌内注射氯胺酮麻醉动物，无菌条件下抽取骨髓，做骨髓涂片，常规瑞氏染色，进行分类，拍照。骨髓涂片显示rhIL-11组，rhTPO低和高剂量组猕猴骨髓象中粒细胞、红细胞、巨核细胞三系增生均活跃，巨核细胞数量增多，以成熟型为主，血小板成堆多见，rhTPO的作用强度与其剂量相关。
三．rhTPO对辐射引起MO7e细胞凋亡的影响
1．rhTPO对辐射后MO7e细胞存活率的影响：
MO7e细胞经<137>铯γ射线5 Gy辐射造模后，随机分成5组，分别与培养液，GM-CSF(10 μg/L)和rhTPO(1，10，μg/L)共同孵育0、24、48和72 h，通过MTT法测定OD值，计算MO7e细胞的存活率。结果显示辐射后24和48 h，rhTPO 10，100μg/L组和GM-CSF组细胞存活率均明显高于辐射对照组(P<0.01，P<0.05)，辐射后72 h，rhTPO 100μg/L组细胞存活率仍明显高于辐射对照组(P<0.01)。其中rhTPO 100μg/L组在辐射后24，48和72 h的细胞存活率显著高于rhTPO 10μg/L组(P<0.01，P<0.05)；在辐射后48和72 h的细胞存活率也明显高于GM-CSF组(P<0.01，P<0.05)。
2．rhTPO对辐射后MO7e细胞凋亡率及细胞周期分布的影响：
另取MO7e细胞，经<137>铯γ射线5 Gy辐射造模后，随机分成4组，分别与培养液，GM-CSF(10μg/L)和rhTPO(10，100μg/L)共同孵育24、36和48 h，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期分布；透射电镜观察MO7e细胞的凋亡形态学变化。结果显示辐射后36 h，rhTPO 10，100μg/L组和GM-CSF组细胞凋亡率均较辐射对照组显著降低(P<0.01)，并且rhTPO 100μg/L组比rhTPO 10μg/L组效果更明显(P<0.01)。辐射后36 h，与正常培养的细胞相比，辐射对照组处于G<,0>/G<,1>期细胞数明显增多(P<0.01)，G<,2>/M期、S期的细胞数明显减少(P<0.05，P<0.01)；而GM-CSF组和rhTPO 100μg/L组处于G<,0>/G<,1>期细胞数均较辐射对照组显著减少(P<0.01)，GM-CSF组和rhTPO 100μg/L组之间无显著性差异(P>0.05)。辐射后24 h，MO7e细胞呈现了典型的凋亡形态学变化，表现为细胞体积缩小；表面微绒毛消失；核染色质固缩聚集于核膜周边，呈不规则块状或新月状；但细胞膜和细胞器均完整。
上述结果提示皮下注射给予rhTPO 4.5，9和18μg·kg<-1>，能剂量依赖性升高辐射后C57小鼠的外周血小板数目，促进辐射后C57小鼠白细胞计数的恢复，增加辐射后C57小鼠骨髓DNA含量。它升高血小板作用比rhIL-11强而起效快；升高白细胞作用比rhIL-11弱而起效慢。皮下注射给予rhTPO 3和9μg·kg<-1>能明显促进用环磷酰胺猕猴的骨髓有核细胞增生，尤其是促进巨核细胞增生及其血小板的形成，作用强度与剂量相关。首次发现rhTPO 10和100μg/L可以浓度依赖性提高辐射后MO7e细胞的存活率，降低凋亡率，可通过减轻细胞的G<,0>/G<,1>期阻滞，使进入S期、G<,2>/M期的细胞数增多，从而抵抗辐射诱导的MO7e细胞凋亡，促进MO7e细胞生长。