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随着医疗技术的快速发展,日益精密先进的放射疗法在肿瘤治疗领域发挥着举足轻重的作用。然而,肿瘤周围的正常组织损伤始终是一个无法根本克服的难题,很大程度上阻碍了放疗的进一步深化应用。为了有针对性地研究出高效低毒的辐射保护剂,首先需要了解辐射损伤的产生机理。目前被广泛接受的是一种氧化应激损伤学说,该学说认为辐射作用于机体后,诱导体内产生过量活性氧类物质(reactive oxygen species, ROS),后者靶向损害DNA、脂质、蛋白质等生物大分子进而引起相关组织功能异常,产生损伤效应。其中,ROS家族包含了多个成员,超氧自由基(superoxide radical, O2)最先产生并通过后续反应可诱发多种其它ROS。可见,清除O2-缓解辐射损伤起着关键作用。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是体内唯一特异性歧化O2-的酶,但是其直接药用存在易降解、稳定性差、半衰期短等不足。为提高此类酶类药物在体内的生物利用度,化学修饰是常用的方法之一。我们在此采用功能性黏多糖肝素作为修饰剂,旨在改善蛋白质药物的自身不足,同时也能整合多种生物学功能,从而协同其药效的发挥。本课题中,我们借鉴前人研究基础,先后分离纯化SOD原料并制备出肝素修饰SOD结合物(Hep-SOD)。通过SDS-PAGE、Native-PAGE、SEC-HPLC、连苯三酚自氧化速率测定法及凝胶渗透色谱-多角度激光散射技术检测SOD及Hep-SOD的纯度、酶比活、分子量等。运用优化的MTT法于体外初步评价Hep-SOD对小鼠肺成纤维细胞L929的辐射防护作用。采用总SOD测试盒检测小鼠外周血中酶活性和Hep-SOD的基本药代动力学参数。参考抗辐射药物的临床前试验指导原则,在小鼠全身水平开展Hep-SOD对辐射损伤防护作用的体内评价。1.猪血SOD原料的分离纯化借鉴前人研究基础,采用DEAE-Sepharose Fast Flow对猪血SOD原料进行分离纯化。联合SDS-PAGE和SEC-HPLC对SOD纯化产品进行纯度的定性和定量检测。结果表明DEAE-Sepharose Fast Flow一步法可将SOD的纯度由87%提高到100%左右。联合BCA蛋白定量和微量连苯三酚自氧化速率法测定活性,纯化后SOD的酶比活由3076u/mg prot提高到4614u/mg prot。2.肝素修饰SOD结合物(Hep-SOD)的制备及其纯度和分子量的测定借鉴前人研究基础,先后经过肝素活化、结合反应及Q-Sepharose Fast Flow分离纯化制备Hep-SOD。采用三硝基苯磺酸法(TNBS法)检测出SOD的平均自由氨基修饰率为32%。通过SDS-PAGE和Native-PAGE检测,发现分离纯化出两种修饰率不同的Hep-SOD,分别为Hep-SOD1和Hep-SOD2。与未修饰SOD相比,Hep-SOD1酶比活保留率为68%,Hep-SOD2的酶比活保留率为40%。借助凝胶渗透-多角度激光散射技术,测得两者的重均分子量(Mw)分别为49.69kDa和61.07kDa。3. Hep-SOD对小鼠L929细胞辐射防护作用的体外评价先后对L929细胞接种密度、产生敏感性照射剂量及照射后检测时间进行筛选,结果表明L929按每孔2000个细胞进行接种,于照后48h进行MTT检测,可对4Gy的X射线产生显著的辐射敏感性。同时,Hep-SOD用药剂量的筛选结果显示：可能源于较高的肝索修饰率,Hep-SOD2的安全剂量范围较窄,仅在500～0μg/ml(即112.5～0U/m1)范围无细胞毒作作用；而Hep-SOD1在考察的剂量范围1000～0μg/ml(即990～0U/m1)内均无细胞毒作用。为方便比较,我们统考察112.5U/ml的Hep-SOD1和Hep-SOD2分别在照前给药和照后给药对L929细胞的辐射防护作用。结果表明：二者照前给药的防护作用突出,相对细胞活力与正常对照组相比无显著差异；而照后给药则无此作用。4. Hep-SOD在小鼠体内基本药代动力学参数的测定对小鼠采用腹腔注射，于给药后不同时间点采血,利用总SOD测试盒检测小鼠外周血中酶活性,并结合相关软件分析。结果表明：Hep-SOD在小鼠体内药动学行为符合二室模型；Hep-SOD1和Hep-SOD2较术修饰SOD体内半衰期均显著延长,尤其是Hep-SOD2的平均滞留时间(MRT)由SOD的(10.28±0.98)h显著延长到了(22.86±3.37)h,表现出更高的生物利用度逆。5. Hep-SOD对小鼠辐射防护作用的体内评价基于Hep-SOD体外评价和基本药代动力学参数的测定结果,在此着重选择具备一定辐射防护效果和较高生物利用度的Hep-SOD2(为简便起见,下文更换名称为Hep-SOD)进行本章的体内药效评价。具体参考抗辐射药物的临床前试验指导原则,系统考察Hep-SOD在受照小鼠全身水平的辐射防护作用。结果显不：Hep-SOD可有效缓解辐射诱发的骨髓抑制；预防组织器官(尤其是肺组织)的氧化应激损伤；阻止辐射导致的外周血谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的异常升高；减轻小鼠肝组织、肺组织及小肠组织的结构病变；整体表现较好的辐射损伤防护作用。但胸腺DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示照前给药有加剧DNA损伤的可能。综上可知,我们对辐射损伤的产生和Hep-SOD防护作用机理的认识还有待进一步加深。本研究取得结果和结论：(1)运用凝胶渗透-多角度激光散射光谱技术测得Hep-SOD重均分子量。(2) Hep-SOD于照射前给药对小鼠肺成纤维细胞L929可表现较好的辐射损伤防护作用。(3)SOD经肝素化修饰后体内保留时间显著延长,生物利用度明显提高；且随其自由氨基修饰率的提高,Hep-SOD表现更好的药代动力学性质。(4)在小鼠辐射损伤模型试验中,Hep-SOD可有效减轻辐射诱发的骨髓抑制,缓解肝组织和肺组织的氧化应激损伤,且抑制肝、肺和小肠的病理形态变化。但是,结果同样显示Hep-SOD照射前给药可能加剧DNA损伤,这为我们全面研究辐射损伤的产生及Hep-SOD的作用机制指明了新的方向。