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研究背景:甲基汞(Methylmercury,Me Hg)是一种环境有害污染物,可通过各种途径进入体内,且在体内代谢比较缓慢,对机体造成损伤。进入机体的Me Hg可在肾脏蓄积,主要沉积在近端小管,肾小管细胞富含线粒体。本研究以Me Hg为处理因素,以人肾近曲小管上皮细胞HK-2为研究对象,系统的探讨Me Hg致HK-2细胞线粒体介导的细胞凋亡,并探讨其相关机制,为Me Hg肾脏毒性作用的研究提供理论依据,为Me Hg毒作用机制及有效的防护提供理论依据。研究目的:研究Me Hg致HK-2细胞的毒性作用,探讨Me Hg致HK-2细胞线粒体介导的Caspase 3依赖通路及非Caspase 3依赖通路细胞凋亡及其机制。研究方法:给予HK-2细胞Me Hg后,MTT法检测细胞存活率;罗丹明123流式细胞术检测细胞线粒体膜电位;Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡;免疫印迹试验检测线粒体细胞凋亡通路相关蛋白的表达;给予细胞PARP-1抑制剂BMN-673ts和/或Caspase 3抑制剂Ac-DEVD CHO,探讨相关机制。研究结果:1.Me Hg对HK-2细胞存活率的影响不同浓度的Me Hg可以降低HK-2细胞存活率。随Me Hg浓度升高,细胞存活率呈剂量依赖性下降(P<0.01)。一定浓度Me Hg处理HK-2细胞不同时间,随着处理时间不断增加,HK-2细胞存活率呈时间依赖性下降(P<0.01)。2.Me Hg对HK-2细胞线粒体膜电位的影响给予不同浓度的Me Hg,可引起HK-2细胞线粒体膜电位下降。流式叠加图中可看到:给药组荧光强度峰的右移。随Me Hg浓度增加,门M1的细胞百分数减少,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。3.Me Hg对HK-2细胞凋亡的影响不同浓度Me Hg作用不同时间均可引起HK-2细胞凋亡。0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μg/m L Me Hg组细胞凋亡、坏死与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01);1.5μg/m L Me Hg处理HK-2细胞1、3、6、9、12、24 h,细胞凋亡同对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。4.Me Hg对HK-2线粒体介导细胞凋亡通路相关蛋白的影响一定剂量的Me Hg作用HK-2细胞不同时间1)对Caspase依赖通路的细胞凋亡相关蛋白的影响。随着给Me Hg时间增加,Cyt C蛋白表达呈升高趋势,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);12 h时Caspase 3蛋白开始表达,24 h组的Pro-Caspase3、Caspase 3蛋白表达增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);Hsp 70蛋白水平下降,与对照组相比无统计学意义。细胞浆蛋白显示:Hsp 70蛋白表达量于1 h时呈上升趋势,随后在3 h时蛋白表达迅速下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。2)对非Caspase依赖通路的细胞凋亡相关蛋白的影响总蛋白中,PARP-1蛋白116、89 k Da片段表达水平呈先上升后下降趋势,1、3、6、9、12 h组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01);PAR聚合物表达在1、3、6、9 h组呈上升趋势(P<0.01),12、24 h组呈下降趋势。67k Da片段的AIF蛋白表达量下降(P<0.01),57 k Da片段表达量上调,24 h组与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。核蛋白中,随着Me Hg处理时间不断增加,PARP-1蛋白116、89 k Da片段表达水平呈先上升后下降(P<0.05);PAR聚合物表达量呈先上升后下降趋势(P<0.05);AIF蛋白(57 k Da)表达量逐渐上升(P<0.01)。5.相关机制探讨在HK-2细胞中加入PARP-1和/或Caspase 3抑制剂,利用MTT法和Annexin V/PI探讨Me Hg致细胞凋亡的作用机制。1)加入不同浓度PARP-1抑制剂BMN-673ts1、10、100 n M、1μM BMN-673ts单独作用于HK-2细胞,对细胞存活率、细胞凋亡均无影响。加入1.5μg/m L Me Hg作用24 h,同Me Hg组比较,细胞存活率增加(P<0.01),细胞凋亡率降低(P<0.01)。2)加入不同浓度Caspase 3抑制剂Ac-DEVD CHO1、10、100μM Ac-DEVD CHO单独作用于HK-2细胞,对细胞存活率、细胞凋亡均无影响。加入1.5μg/m L Me Hg作用24 h,同Me Hg组比较,细胞存活率增加(P<0.01),细胞凋亡率降低(P<0.01)。3)加入BMN-673ts和Ac-DEVD CHO给予HK-2细胞10 n M BMN-673ts和100μM Ac-DEVD CHO后,对细胞凋亡均无影响。加入1.5μg/m L Me Hg作用24 h,同Me Hg组比较,细胞凋亡率降低(P<0.01)。同10 n M BMN-673ts+1.5μg/m L Me Hg组比较,细胞凋亡率降低。同100μM Ac-DEVD CHO+1.5μg/m L Me Hg组,细胞凋亡率无差别。结论:1.Me Hg可以通过线粒体介导的PARP-1/AIF、Cyt C/Caspase 3两条途径引起HK-2细胞发生凋亡。2.抑制PARP-1/AIF、Cyt C/Caspase 3两条途径均可以降低HK-2细胞凋亡。3.Me Hg引起HK-2细胞线粒体途径细胞凋亡伴有细胞坏死的发生。