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转酮酶(EC2.2.1.1)是非氧化磷酸戊糖途径中的关键酶,催化酮基在酮糖与醛糖之间可逆的转移。尽管前人的工作表明转酮酶在芳香族氨基酸的合成中起重要的作用,但是到目前为止,对于棒杆菌属纯化的转酮酶的研究还没有报道。本论文工作进行北京棒杆菌转酮酶的表达、纯化以及双底物动力学性质的研究。研究结果表明,北京棒杆菌的转酮酶在溶液中以同源二聚体的形式存在,分子量为147.4kDa,以二价金属离子(Mg2+)和焦磷酸硫胺素(TPP)为辅因子。双底物稳态动力学研究结果表明,该酶催化的反应是以乒乓双双(Ping-PongBi-Bikineticmechanism)机制进行的。转酮酶的动力学参数如下:KmXu5P0.63±0.15,KmR5P1.87±0.057,KmE4P0.13±0.067,KmF6P0.20±0.03,KmGA3P0.11±0.05mM,kcat(reactionⅠ)47.10,kcat(reactionⅡforward),13.38,kcat(reactionⅡreverse)5.63s-1。通过测定转酮酶催化可逆反应中的底物在细胞内的浓度,结合生理条件下测定的转酮酶动力学参数推测,在生长的对数后期,转酮酶催化的可逆反应Ⅱ进行的方向为朝向3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖的生成。
另一方面,本论文工作分别以C.pekinenseAS1.299以及它的突变株PD-67的基因组为模板,根据与其具有高同源性的C.glutamicumATCC13032的转酮酶基因设计引物,扩增了转酮酶基因,并且对以上三种来源的转酮酶基因的核苷酸和氨基酸残基序列进行了比对。转酮酶基因在PD-67中实现了表达,转酮酶活力提高了2倍。发酵实验结果表明,重组菌与对照菌株相比,生长加快。至发酵结束时,重组菌的细胞量比对照菌高了27％。转酮酶酶活力增加有助于C.pekinensePD-67的L-色氨酸积累,与对照菌相比,重组菌的L-色氨酸积累提高6.85％。