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植物处于极端恶劣的环境下,体内产生胁迫应答反应,诱导相应应答基因的表达,提高了植物的胁迫耐受力。水稻基因组水平分析已经表明,许多转录因子的表达受环境胁迫的诱导或抑制,它们的表达受复杂信号网络的调节。ABA信号途径是各种不同环境胁迫因子共同利用的途径,在整个信号转导过程中,特定的转录因子起关键作用。
本论文旨在研究水稻中bZIP类转录因子OsABI5在此信号转导途经和植物发育过程中的功能。论文主要研究结果如下:
1.利用RT-PCR的方法在水稻幼穗中分离了OsABI5基因,序列测定和Southernblotting结果表明获得了该基因两个可变剪切转录本--OsABI5-1与OsABI5-2,二者相差30个碱基,其编码的10个差异氨基酸位于碱性亮氨酸拉链之后。基因序列分析表明,OsABI5-1与OsABI5-2都具有完整的bZIP结构域,同属于bZIP类转录因子,与拟南芥AtABI5、大麦HvABI5氨基酸序列有高的同源性。基因表达模式分析表明,该基因不仅受低温、干旱、盐的非生物环境胁迫的诱导或抑制,也受植物激素ABA的诱导。OsABI5-1与OsABI5-2在不同组织中表达模式不同,叶中二者表达量基本相同,而在根与幼穗中二者表达差异明显。
2.对OsABI5蛋白的转录激活活性、DNA结合性、聚合性进行了分析,结果表明OsABI5-1与OsABI5-2都有较强的转录激活活性;OsABI5-1不能与ABA应答G-box元件(5…CACGTG…3)结合,OsABI5-2能够与G-box元件结合,启动报告基因的表达,表明二者有可能识别不同的反应元件;OsABI5-1与OsABI5-2蛋白的核定位信号位于碱性区域,亚细胞定位实验证明二者均定位在核里,由此表明OsABI5-1与OsABI5-2作为转录因子调节基因表达。pull down分析表明OsABI5-2蛋白自身可以相互作用,与OsABI5-1蛋白间也存在相互作用,OsABI5-1和OsABI5-2蛋白分别与OsVP1蛋白间也存在互作关系,说明三者间有可能形成一个蛋白复合物,共同调控下游基因的表达。
3.利用正向和反向RNA技术,将OsABI5-2基因转化水稻,获得了过量表达和反义抑制表达的转基因植株。转反义OsABI5-2基因的表达使转基因植株中内源OsABI5基因转录水平降低,表现出植株的结实率降低。同时,转基因植株幼苗对盐胁迫耐受力的分析表明,过表达OsABI5-2基因的植株对盐胁迫的敏感性增强,过表达转基因植株在盐胁迫下均表现矮小、逐渐枯萎、死亡,;对照植株反应稍微缓慢,茎部还呈现部分绿色;反义抑制OsABI5基因的表达后,水稻植株表现出明显耐盐性,生长势强。与拟南芥突变体abi5-1的互补实验结果表明,在abi5突变体中过表达OsABI5-1或OsABI5-2基因都可以恢复abi5突变体对ABA的敏感性。同时,在野生型中过表达OsABI5-1或OsABI5-2基因都可以提高野生型种子萌发过程中对ABA的敏感性。RT-PCR分析反义转基因植株中胁迫诱导基因的表达发现,SKC1,SalT,aba45等基因的表达由于OsABI5基因表达抑制而变化,表明这些marker基因可能与OsABI5基因处于同一条信号通路。上述结果表明,OsABI5基因功能与ABA敏感性和种子萌发相关,并参与水稻的育性和耐逆性调节。
4.构建了ABA处理下特异表达的消减文库,经过筛选后,获得了24个在ABA及寒冷、干旱胁迫下特异表达的cDNA片段,构建成胁迫反应应答基因阵列,利用转基因株系,检测OsABI5-1及OsABI5-2表达变化后,这些胁迫反应基因的表达变化情况,以期认识OsABI5-1与OsABI5-2的不同生物学功能以及参与的调控网络。