(一)芪珠方治疗慢性乙型病毒性肝炎脾虚湿热证的临床研究目的:观察芪珠方联合恩替卡韦分散片治疗慢性乙型病毒性肝炎脾虚湿热证的疗效和安全性。方法:73例慢性乙型病毒肝炎脾虚湿热证患者随机分2组,研究组35例以芪珠方联合恩替卡韦分散片口服治疗,对照组38例以恩替卡韦分散片口服治疗,疗程均为1年。观察芪珠方治疗慢性乙肝的抗病毒疗效、中医证候学疗效、肝功能改善情况以及安全性。结果:研究组35例,HBVDNA阴转率为94.28%,HBeAg阴转率为35.71%,HBeAg血清学转换率为28.57%。ALT复常率为94.28%。中医证候疗效:临床痊愈10例(29%),显效18例(51%),有效6例(17%),无效1例(3%)。对照组38例,HBVDNA阴转率为89.74%,HBeAg阴转率为20.00%,HBeAg血清学转换率为13.33%。ALT复常率为94.73%。中医证候疗效:临床痊愈7例(18%),显效10例(26%),有效16例(42%),无效5例(13%)。两组患者未见明显不良反应。结论:两组治疗后肝功能、症状均较治疗前有明显改善,乙肝病毒复制被有效抑制。两组在乙肝病毒DNA阴转、HBeAg阴转、HBeAg血清学转换、ALT复常率方面,疗效无明显差异。中医证候改善方面,研究组优于对照组(P<0.05)。芪珠方治疗慢性乙型病毒肝炎脾虚湿热证安全性良好。(二)芪珠方通过抑制NF-κB信号通路抑制肝脏炎症、抗肝细胞癌以及抑制乙肝病毒复制的实验研究目的:探讨芪珠方抗肝脏炎症、抗肝细胞癌以及抑制乙肝病毒复制的作用及其机制。方法:1.建立DEN诱导的小鼠慢性肝炎模型,观察芪珠方提取物对小鼠肝脏炎症的作用;肝组织HE染色观察肝脏组织形态;免疫组织化学法检测芪珠方提取物对小鼠肝脏炎症相关分子蛋白的表达。2.实时荧光定量PCR法检测芪珠方提取物对HBV转基因小鼠肝脏TNF-α mRNA、IL-1β mRNA的表达,免疫印迹研究检测芪珠方提取物对HBV转基因小鼠肝脏TNF-α、IL-1β、p-p65的表达。3.建立DEN诱导的小鼠肝癌模型,观察芪珠方提取物对小鼠肝癌的作用;免疫组织化学法检测芪珠方提取物对小鼠肝癌相关分子蛋白的表达。4.伤口愈合试验观察芪珠方提取物抑制原发性肝癌细胞转移的作用。5.流式细胞仪检测芪珠方提取物对原发性肝癌细胞增殖的作用。6.酶联免疫吸附试验、免疫印迹试验分析芪珠方提取物对HBV转染的HepG2细胞、PLC/PRF/5细胞的HBsAg和HBeAg分泌的影响。7.Southern blot法分析芪珠方提取物对HBV转染的HepG2细胞HBV DNA复制的影响。8.实时荧光定量PCR测定芪珠方提取物对鸭乙肝病毒感染广州麻鸭和HBV转基因小鼠HBVDNA合成的影响。9.液相色谱-质谱法分析芪珠方的主要有效成分。结果:1.芪珠方QC能显著下调肝炎小鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平,抑制小鼠肝脏中TNF-α和IL-1β的mRNA表达,抑制小鼠肝脏中TNF-α、IL-1β和p-p65的蛋白表达。2.芪珠方提取物能显著抑制HBV转基因小鼠肝脏中TNF-α和IL-1β的mRNA表达,抑制小鼠肝脏中TNF-α、IL-1β和p-p65的蛋白表达。3.芪珠方提取物显著下调肝癌小鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平,抑制肝癌小鼠肝脏中TNF-α和IL-1β的mRNA表达,抑制肝癌小鼠肝脏中TNF-α、IL-1β和p-p65的蛋白表达。4.伤口愈合试验:细胞膜被划伤Oh、12h和24h后,芪珠方QC和QS处理的肝癌细胞迁移明显降低。芪珠方QC和QS显著增加E-cadherin的表达、降低N-cadherin的表达。5.芪珠方QC和QS降低了 DEN诱导的肝癌细胞G2期和S期的细胞数。QC和QS处理的肝癌细胞表现出Cyclin B1和Cyclin D1下调。CCK-8实验表明,QC和QS干预后,肝癌细胞的增殖明显下降。细胞集落形成试验表明,QC和QS剂量依赖性地抑制肝癌细胞的增殖。芪珠方QC和QS培养的肝癌细胞凋亡率(2.6%和4%)高于对照组(0.4%)。芪珠方QC和QS增加caspase-3、PARP的表达,降低Bcl-2的表达。芪珠方QC和QS可以显著抑制p65的磷酸化。敲低p65后,芪珠方QC和QS不能显著抑制原发肝癌细胞的增殖。6.芪珠方提取物使HBV转染的HepG2细胞、PLC/PRF/5细胞HBsAg、HBeAg表达明显下降。7.芪珠方提取物抑制HBV转染的HepG2细胞HBVDNA的复制。8.芪珠方提取物抑制感染鸭乙肝病毒广州麻鸭DHBVDNA的合成,抑制乙肝病毒转基因小鼠HBVDNA的合成。9.柯里拉京和白藜芦醇苷是芪珠方的主要有效成分。结论:芪珠方通过抑制NF-κB通路抑制小鼠慢性肝炎。芪珠方通过NF-κB通路抑制DEN诱发肝细胞癌。芪珠方有效抑制HBVDNA的复制。柯里拉京和白藜芦醇苷是芪珠方的主要有效成分。