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大肠埃希菌（Escherichia coli）是临床上分离率最高的革兰阴性菌之一,是一种条件性致病菌,可引起肠道内或肠道外的感染,甚至导致死亡。由于畜牧生产和兽医临床实践中抗菌药物的不规范使用甚至滥用,导致细菌耐药性增加,细菌耐药性问题日益严重,给畜牧业发展和兽医公共卫生造成危害。生物被膜的形成是大肠埃希菌耐药性产生和耐药水平增加的重要原因。因此寻找新的生物被膜抑制剂对抗耐药菌感染十分紧迫（杨进等2022）。天然药物资源丰富,从中筛选细菌生物被膜抑制剂是防控耐药菌和新兽药创制的重要途径。本论文以分离的禽源产ESBLs多重耐药大肠埃希菌为研究对象,分析了短穂兔耳草、獐牙菜在内的6种藏药对其抗菌活性,进一步研究了短穂兔耳草和獐牙菜对其生物被膜的干预作用。主要研究内容及结果总结如下:1.禽源大肠埃希菌的分离鉴定、耐药性分析、分子分型和生物被膜测定采用麦康凯、伊红美蓝鉴别培养基、革兰氏染色镜检、16S r DNA鉴定等方法对来自陕西渭南地区三个不同规模的肉鸡养殖场的肉鸡粪便样本进行大肠埃希菌的分离与鉴定,共分离得到131株大肠埃希菌。用CLSI推荐的微量稀释法测定10种抗菌药物对分离株的最小抑菌浓度（MIC）,利用PCR扩增法检测了分离菌株携带的毒力基因。药敏试验结果显示,131株大肠埃希菌呈现多重耐药,对多西环素、头孢噻呋、头孢曲松、恩诺沙星、氟苯尼考、氨苄西林等耐药,尤其对头孢噻呋、头孢曲松、氟苯尼考、头孢噻肟以及氨苄西林的耐药率达到100%。对美罗培南、阿米卡星、多黏菌素E的敏感性较好。毒力因子检测结果显示,pap C检出率最高,达85.5%。ast A次之,为84.7%。50%以上的分离株携带iuc D、iro N、iss中的一种以上的基因。iut A、tsh、irp-2基因的检出率较低,介于23.7%～43.5%。cva检出率不足10%,vat基因未检测到。采用双纸片扩散法测定耐药菌株超广谱β-内酰胺酶菌（ESBLs）,并采用多位点序列分型（MLST）对产ESBLs菌进行分子分型。共筛选获得20株产ESBLs菌株,分别属于7种ST型（ST1266、ST162、ST10、ST38、ST1485、ST2847、ST469）,均为已知ST型,其中ST162和ST10为主要的ST型。采用结晶紫染色法对产ESBLs菌进行生物被膜形成能力分析,从中筛选产膜能力较强的菌株,结果显示20株产ESBLs菌株均为生物被膜阳性菌株,其中中等产膜能力菌株8株（40%）,弱产膜能力菌株12株（60%）。2.6种藏药对大肠埃希菌的体外抗菌活性采用纸片扩散法及试管二倍稀释法测定了6种藏药（獐牙菜、短穗兔耳草、钩藤、铁棒锤、乌奴龙胆、甘青青兰）对受试菌的抑菌活性,筛选出抑菌活性较好的藏药进行后续研究。纸片扩散法结果显示,除了铁棒锤之外,各药水提物对受试菌株都具有抑菌作用。除乌奴龙胆、铁棒锤外各药的醇提物对受试菌都具有抑菌作用。试管二倍稀释法结果显示,不同藏药对受试大肠埃希菌均具有抑菌作用,但其抑菌效果不尽相同,其中短穗兔耳草和獐牙菜对受试菌抑菌效果最好（短穗兔耳草MIC值介于15.7～125.0mg/m L,獐牙菜MIC介于15.7～125.0 mg/m L）。总体来看,水提物的抑菌效果更好。3.短穗兔耳草和獐牙菜对大肠埃希菌生物被膜的干预作用通过生长曲线、结晶紫染色法、扫描电镜、激光共聚焦显微镜测定短穗兔耳草和獐牙菜水提物对受试菌株生物被膜的作用。生长曲线结果显示,短穗兔耳草和獐牙菜水提物均可抑制受试菌的生长并呈现浓度依赖性。结晶紫染色法结果显示,加入不同浓度短穗兔耳草、獐牙菜水提物处理后,生物被膜的形成受到抑制,且可以清除已经成熟的生物被膜,两者水提物均有较好的抗生物被膜活性,并且呈现浓度依赖性。MIC、1/2MIC、1/4 MIC浓度的短穗兔耳草水提物均可抑制生物被膜的形成,抑制率分别介于35.7%～79.9%、20.1%～71.3%、0%～51.4%。在MIC、1/2 MIC、1/4 MIC浓度下,獐牙菜水提物对受试菌的抑制率分别介于28.3%～76.0%、16.0%～71.0%、0%～58.3%;在MIC、1/2 MIC、1/4 MIC浓度下,獐牙菜水提物对生物被膜的清除率分别介于15.3%～63.0%、0%～61.7%、0%～56.0%,而短穗兔耳草为27.6%～62.3%、15.6%～57.1%、0%～41.2%。獐牙菜水提物对生物被膜的抑制和清除率最高分别可达76.0%、63.0%;短穗兔耳草水提物对生物被膜的抑制和清除率最高分别可达79.9%、62.3%。扫描电镜结果显示,在加入MIC、1/2 MIC、1/4 MIC短穗兔耳草、獐牙菜水提物处理之后,与未加药相比,生物被膜结构分散,大肠埃希菌聚集性差,生物被膜结构遭到明显破坏,并随着浓度增高,作用效果越为明显。激光共聚焦显微镜结果进一步证实了短穗兔耳草和獐牙菜的作用,药物处理之后,与未加药相比,绿色荧光面积显著下降,红色荧光面积增多。结果表明,短穗兔耳草和獐牙菜可以抑制和清除大肠埃希菌生物被膜,并呈现浓度依赖性。