论文部分内容阅读
性别决定因子Sox2(SRY related HMG-box, SOX)-2和转录因子Oct4(Octamer-binding transcription factor4)能够维持多能干细胞的多能性以及自我更新,同时也是体外制备诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS)的主要基因。c-Myc属于原癌基因,与许多类型肿瘤的形成、生长有关,参与调控细胞分裂和细胞凋亡过程。同时也是参与体外诱导多能干细胞的基因之一。本研究采用PCR方法获取了Sox2基因、c-Myc基因和Oct4基因5’侧翼区一系列缺失片段,定向克隆至PGL3-Basic载体。运用双荧光素酶报告基因检测系统检测Sox2基因、c-Myc基因和Oct4基因启动子活性并确定其启动子基本活性区域。利用碱基定点突变技术、双荧光素酶报告基因检测系统找出参与调控Sox2、c-Myc和Oct4基因基本转录活性的关键转录因子。为进一步研究Sox2、Oct4和c-Myc基因的转录调节机制以及更深入了解其在干细胞发育过程中的作用机理。同时也为提高诱导多能干细胞的制备效率奠定理论基础。主要研究结果如下：1.分别克隆了Sox2基因5’侧翼序列(-1792-+49bp)一系列不同长度的截短片段、c-Myc基因5’侧翼序列(-1976-+1bp)一系列不同长度的截短片段和Oct4基因5’侧翼序列(-1936-+30bp)一系列不同长度的截短片段。成功构建了含有Sox2基因不同大小片段启动子的重组表达载体PGL3-Sox2pro, c-Myc基因不同大小片段启动子的重组表达载体PGL3-c-Mycpro, Oct4基因不同大小片段启动子的重组表达载体PGL3-Oct4pro。2.为了验证Sox2基因,c-Myc基因和Oct4基因有无启动子活性,将pEGFP-N1载体中的CMV启动子分别置换为-1298-+49bp,-1334-+1bp以及-1516～+30bp启动子片段,获得重组载体pEGFP-N1/p1298, pEGFP-Nl/p1334和pEGFP-N1/p1516。转染羊胎儿成纤维细胞后,均能检测到绿色荧光,表明Sox2基因,c-Myc基因和Oct4基因的长片段均能启动EGFP的表达,具有启动子活性。3.用包含不同长度的Sox2基因启动子的荧光素酶载体,不同长度c-Myc基因启动子的荧光素酶载体,不同片段大小的Oct4基因启动子的重组载体转染山羊胎儿成纤维(gEF)、猴肾(COS7)和小鼠畸胎瘤细胞(P19),转染24h后,收集细胞,利用双荧光素酶报告基因检测系统测定其启动子活性。结果显示：不同长度的Sox2基因启动子在以上3种细胞中均表现出不同程度的活性。其中片段-1298-+49bp活性最高,片段-109-+49bp活性最低,-224-+49bp之间存在着Sox2启动子的基本调控元件。-484～-109bp、-755～-1249bp区域存在重要的正调控元件,-533--755bp、-1249～-1792bp区域存在重要的负调控元件。不同长度的c-Myc基因启动子在以上3种细胞中均表现出不同程度的活性。c-Myc基因启动子片段-1334～+1bp活性最高,片段-147-+1bp活性最低,-402-+1bp之间存在着c-Myc启动子的基本调控元件。-1344～-971bp、-587～-147bp区域含有关键的正调控元件,一1976～-1334bp.-971--587bp区域存在重要的负调控元件。在以上3种细胞中,Oct4基因不同大小片段的启动子都能够检测到不同强度的活性。Oct4基因启动子-1516～+30bp片段活性最高,片段-96-+30bp活性最低。启动子基本活性区域为-238～+30bp；-1516～-946bp,-615～-96bp区域存在重要的正调控元件。而-1936-一1516bp、-946～-615bp区域存在重要的负调控元件。4.通过TFSEARCH预测,Sox2基因转录起始位点上游-224--109bp区域含有NF-Y,SP1,Elf-1,AP-2等转录因子结合位点,c-Myc基因转录起始位点上游-402～-147bp区域包含SP1,C/EBP,Adf-1,NF-kap等转录因子结合位点,Oct4基因转录起始位点上游-238--96bp区域存在SP1,STRE,MZF1,AML-1a等转录因子结合位点。对各基因预测的转录因子结合位点进行碱基定点突变,对比突变前后启动子活性的变化。结果表明：Sox2基因-224～-109bp区域的Elf-1和AP-2是参与调控其基本转录活性的关键转录因子,c-Myc基因-402～-147bp区域的SP1和C/EBP是参与调控其基本转录活性的关键转录因子,Oct4基因-238～-96bp区域的SP1与MZF1是参与调控其基本转录活性的关键转录因子。5.在转染重组荧光素酶载体的基础上,采用终浓度为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L和15μmol/L的甲基化抑制剂5-Azadc(5-aza-2’-deoxycytidine),终浓度为0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L以及1.5μmol/L的去乙酰化酶抑制剂TSA(Trichostatin A).浓度为1mmol/L、2μmol/L、4mmol/L以及6mmol/L VPA(Valproic acid)和浓度为0.1μmol/L.0.5μmol/L、1μmol/L和1.5μmol/L的NFAT1(Nuclear factor of activated T cells)筛选最佳诱导浓度。另外,对Sox2基因,c-Myc基因和Oct4基因组进行亚硫酸氢盐测序(Bisulfite sequencing PCR, BSP).结果显示,Sox2基因,c-Myc基因和Oct4基因均存在甲基化和乙酰化修饰作用,5-Azadc、TSA、VPA和NFAT1的最佳诱导浓度分别为10μmol/L、1μmol/L、4mmol/L以及1μmol/L。