盐和干旱胁迫下水稻种子萌发关键位点挖掘及qSG3位点候选基因预测

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随着土壤盐碱化程度加剧以及全球气候变化,盐胁迫和干旱胁迫已成为威胁水稻生产的重要非生物胁迫因素。种子萌发是作物生长发育的重要环节,受盐胁迫和干旱胁迫影响较大。研究盐害和干旱胁迫条件下水稻种子快速萌发和成苗的分子调控机制,挖掘调控种子萌发期耐盐和抗旱相关基因,对于培育耐盐和抗旱水稻品种具有重要意义。本研究以已测序的168份水稻种质资源(自然群体)作为研究材料,检测正常条件、盐胁迫和模拟干旱胁迫条件下种子萌发关键位点,挖掘耐盐和抗旱相关候选基因并进行功能验证。主要研究结果如下:1、对2017年秋季收获大田种植的168份水稻种质的种子,以种子发芽率(Germination rate,GR)、发芽率达到 50%所需时间(T50)、发芽指数(Germination index,GI)和种子萌发等级(Germination level,GL)为指标,测定正常条件(H2O)、盐胁迫(200mMNaCl)和模拟干旱胁迫(20%PEG6000)下的种子萌发情况。在正常条件下,该水稻自然群体的GR、T50、GI和GL的平均值分别为98.49%、2.05 d、12.35和9.43,它们的变异系数分别为2.14%、23.50%、15.96%和6.46%;盐胁迫条件下,该水稻自然群体的GR、T50、GI和GL的平均值分别为93.84%、4.20 d、6.96和7.35,变异系数分别为10.90%、34.64%、27.25%和14.96%;模拟干旱胁迫条件下,该水稻自然群体的GR、T50、GI和GL的平均值分别为88.15%、4.51 d、6.29和6.97,变异系数分别为19.84%、43.51%、31.86%和21.58%。结果表明,在正常条件、盐胁迫和模拟干旱胁迫等三种不同萌发条件下,该水稻自然群体种子的种子发芽率(GR)、发芽率达到50%所需时间(T50)、发芽指数(GI)和种子萌发等级(GL)等都存在广泛的遗传变异,盐胁迫和模拟干旱胁迫显著抑制水稻种子的萌发。2、根据三种萌发条件下测得的168份水稻种质种子的GR、T50、GI和GL值,使用有效混合模型(Efficient mixed model association eXpedited,EMMAX)进行全基因组关联分析(Genome-wide association analysis,GWAS),检测与种子萌发性状显著相关的位点。在正常条件、盐胁迫和模拟干旱胁迫下分别检测到17、41和35个与种子萌发性状显著相关的位点。其中,正常条件下,检测到控制GR、T50、GI和GL性状的位点分别为4、1、8和4个,有4个位点至少在两种指标共同检测到;盐胁迫条件下,检测到控制GR、T50、GI与GL的位点分别为6、4、8和23个,有8个位点至少在两种以上指标共同检测到;模拟干旱胁迫条件下,检测到控制GR、T50、GI与GL的位点分别为5、5、4和21个,有7个位点至少在两种指标共同检测到。将三种萌发条件下两个以上种子萌发指标共同检测到的19个位点,分别命名为L1--L19,并与实验室2015年的研究测定的数据进行比对,发现4个在2015和2017年稳定表达的位点。其中,一个位点在正常、盐胁迫和干旱胁迫下能同时被检测到,可能是控制种子萌发的关键位点,命名为qSG3。3、对种子萌发关键位点qSG3进行了候选基因分析与功能验证。在qSG3区域内预测到20个候选基因;根据候选基因功能注释和同源基因报道,结合基因单倍型分析,推测LOC Os03g27280(OsSAPK1)和LOCOs03g27590(OsSCP18)可能为目标基因。在水稻自然群体中,OsSAPK1和OsSCP18都存在两类单倍型,在盐和干旱胁迫下,含有单倍型hap1的水稻种子萌发能力显著高于含有单倍型hap2的水稻资源。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的ossapk1和osscp18纯合突变体,在正常条件下发现突变体种子活力显著低于对照亲本(WT),进一步证明OsSAPK1和OsSCP18可能为qSG3位点的候选基因。4、利用胁迫下种子萌发等级≥8.0和候选基因优异单倍型hap1,筛选耐盐和抗旱水稻资源。鉴定到8份既耐盐又抗旱的优异种质资源,分别为EMATAA 16-34、SLO 17、Honduras、KPF-16、Saber、Berenj、Saturn 和 Chiem Chanh。本研究结果为进一步克隆和解析水稻种子萌发关键位点qSG3基因功能及培育种子萌发期耐盐抗旱的水稻新品种提供基础。
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